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1、第三章第三章 细胞培养的污染和排除细胞培养的污染和排除细胞培养技术细胞培养技术细胞污染细胞污染: : 凡混入培养环境中对细胞生存凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分有害的成分和造和造成成细胞不纯细胞不纯的异物，都应视为污染。的异物，都应视为污染。微生物的污染微生物的污染不同细胞类型的交叉污染不同细胞类型的交叉污染细菌细菌霉菌霉菌支原体支原体化学物质污染化学物质污染病毒病毒污染途径：污染途径：空气空气: : 培养设施不宜置于通风场所；培养设施不宜置于通风场所； 定期清理净化工作台的过滤层，防止阻塞；定期清理净化工作台的过滤层，防止阻塞；操作中应减少空气流动；带口罩；操作中应减少空气流动；带口罩；
2、夏季潮湿季节空气中含菌数量多，夏季潮湿季节空气中含菌数量多，每立方米内含菌数不应超过每立方米内含菌数不应超过1 15 5个。个。 清洗消毒清洗消毒培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。都可引入有害物。操作操作实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎，使用同一吸管或培养用液，可培养两种以上细胞，操作不慎，使用同一吸管
3、或培养用液，可能导致细胞交叉污染。能导致细胞交叉污染。 血清血清血清血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。测不严，常已被支原体和病毒污染。组织组织初初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织可能是被污染的组织( (如已经如已经发生溃烂的肿瘤组织发生溃烂的肿瘤组织) )；手术用碘；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染 污染对细胞的影响污染对细胞的影响 在细胞受有害物污染时间短、污染程度轻、并能在细胞
4、受有害物污染时间短、污染程度轻、并能及时排除污染物的情况下，细胞及时排除污染物的情况下，细胞有可能有可能恢复。恢复。当污染物持续存在于培养环境中时，当污染物持续存在于培养环境中时，轻者轻者细胞增细胞增殖生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓殖生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强，增强，重者重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。 1 1细菌污染细菌污染：细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中
5、加入了抗菌素中加入了抗菌素( (一般为预防剂量一般为预防剂量) )，也可能因为操作不慎而引起污，也可能因为操作不慎而引起污染。染。细菌细菌污染后大多能改变污染后大多能改变培养液培养液pHpH使培养液变使培养液变混浊混浊，毒性大的细，毒性大的细菌很快菌很快导致导致细胞崩解死亡。细胞崩解死亡。加加用抗生素的培养用液一般可预防和用抗生素的培养用液一般可预防和排除排除个别个别少量少量细菌的污染。细菌的污染。2 2真菌污染：真菌污染：真菌种类繁多，形态各异，在霉雨季节更易污染。真菌种类繁多，形态各异，在霉雨季节更易污染。真菌污染后，培养液一般真菌污染后，培养液一般不发生混浊不发生混浊，但污染后均不难发现
6、，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。和细胞之间生长。支原体污染支原体污染支原体是细胞培养中支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉最常见、不易被察觉和和干扰实验结果干扰实验结果的的一种污染。一种污染。 支原体一般支原体一般过滤除菌无法过滤除菌无法去除，开始去除，开始不易不易发现
7、发现，能在偏碱条，能在偏碱条件件(pH7.6(pH7.68.0)8.0)下生存，对下生存，对青霉素有青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间或散在于细胞之间。培养。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可可见。见。细胞生长细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细细胞胞污染后无明显变化，或略有变化污染后无明显变化，或略有变化，4.4.病毒病毒污染污染采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒潜在病毒的的组织培养物，会产生病毒污染。目前，
8、从组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代原代猴肾细胞的培养猴肾细胞的培养中已发现不少于中已发现不少于2020种血清性病毒种血清性病毒。5.5.非同种细胞非同种细胞污染污染由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有没有严格严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种一种细胞污染。如细胞污染。如“灵长类灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞系发现猴和鼠类细胞的细胞的混合物，混合物，ERK/KDERK/KD细胞是从细胞是从兔肾中分离出来的兔肾中分离出来的，而，而现在却认为是现在却认为是HeLaHeLa细胞。细胞。真菌真菌感染
9、 支原体污染污染 电镜照. 细菌污染污染扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体污染的预防和排除污染的预防和排除重在预防，排除困难！重在预防，排除困难！1 1抗生素排除法：抗生素排除法：一些有价值的细胞被污染后，可采用一些有价值的细胞被污染后，可采用5 51010倍倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24244848小时，再换入常规培养液。有时可能奏效。小时，再换入常规培养液。有时可能奏效。2.2.加温除菌加温除菌 ( (用于清除支原体）用于清除支原体） 根据根据支原体耐热性能差支原体耐热性能差的特点。有人将受支原的特点。有人将受支
10、原体污染的细胞置于体污染的细胞置于4141中作用中作用5 51010小时小时( (最长可最长可达达1818小时小时) )以杀灭支原体。但以杀灭支原体。但4141对培养细胞本对培养细胞本身也有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，身也有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。处理时间。 3.3.动物体内接种动物体内接种 受微生物污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下受微生物污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔，或腹腔，借动物体内免疫系统消灭污染的微生物，借动物体内免疫系统消灭污染的微生物，肿瘤细胞却能在体
11、内继续生长，待一定时间后，从肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出再进行培养繁殖。体内取出再进行培养繁殖。4.4.与巨噬细胞共培养与巨噬细胞共培养巨噬细胞在体外培养条件下仍然可吞噬微生物并将巨噬细胞在体外培养条件下仍然可吞噬微生物并将其消化。其消化。利用利用9696孔培养板将极少量的培养细胞与巨噬孔培养板将极少量的培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度的同时，更有效地发挥巨噬细胞清除微生物污染程度的同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染的效能。污染的效能。本方法与抗生素联合应用效果更佳。本方法与抗生素联合应用效果更佳。课后思考题：课后思考题：1.1.细胞培养中污染主要通过哪些途径？细胞培养中污染主要通过哪些途径？2.2.细胞培养中常见有哪些微生物污染，细胞培养中常见有哪些微生物污染，如何排除细胞污如何排除细胞污染染？