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1、第第34讲基因工程讲基因工程()DNA的的粗提取与鉴定及其粗提取与鉴定及其PCR技术技术 生物技术与工程生物技术与工程（选择性必修（选择性必修3 3）第十单元第十单元等级考等级考(2017级级)课标要求课标要求内容标准内容标准活动要求活动要求1DNA的粗提取和鉴定。的粗提取和鉴定。2利用聚合酶链式反应利用聚合酶链式反应(PCR)扩增扩增DNA片段并完成电片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。实验。栏目导航考点一考点一DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定考点二考点二课堂小结课堂小结内化体系内化体系随堂演练随堂演练巩固提升巩固提升1提取生物大分子的基本思路
2、：提取生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学方法分离具有不同选用一定的物理或化学方法分离具有不同_性质的生物大分子。性质的生物大分子。2DNA粗提取与鉴定的原理粗提取与鉴定的原理(1)DNA粗提取原理：利用粗提取原理：利用DNA与与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取面的差异，提取DNA，去除其他成分。，去除其他成分。考点一考点一DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 物理或化学物理或化学 DNA与蛋白质在物理、化学性质方面的差异如下：与蛋白质在物理、化学性质方面的差异如下：比较项目比较项目DNA蛋白质蛋白质溶解性溶解性2 mol/L NaC
3、l溶液中溶液中析出析出0.14 mol/LNaCl溶液中溶液中酒精溶液中酒精溶液中耐受性耐受性蛋白酶蛋白酶无影响无影响水解水解高温高温_以上变性以上变性不能忍受不能忍受_的的高温高温溶解溶解析出析出溶解溶解析出析出溶解溶解806080洗涤剂能够瓦解洗涤剂能够瓦解_，但对，但对DNA没有影响。没有影响。(2)鉴定原理：鉴定原理：DNA在在_条件下，遇二苯胺会被染成条件下，遇二苯胺会被染成_色。色。细胞膜细胞膜 沸水浴沸水浴 蓝蓝DNA含量相对较高含量相对较高 蒸馏水蒸馏水 洗涤剂洗涤剂 (3)去去除除滤滤液液中中的的杂杂质质 NaCl溶液溶液 嫩肉粉嫩肉粉 木瓜蛋白木瓜蛋白 水浴箱水浴箱 酒精酒
4、精 静置静置 白色丝状物白色丝状物 玻璃棒玻璃棒 丝状物丝状物 2 mol/L 丝状物丝状物 NaCl溶液溶液 二苯胺二苯胺 沸水浴沸水浴 变蓝变蓝 4操作提示操作提示(1)实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血的主要原因是实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血的主要原因是_ _。为防止血液凝固需要加入。为防止血液凝固需要加入_。(2)实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，玻璃容器吸附实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，玻璃容器吸附DNA，会使提取到，会使提取到的的DNA更少。更少。(3)破碎细胞，释放破碎细胞，释放DNA的过程中，若实验材料是鸡血细胞液，则加水后必须的过程中，若实验材料是鸡血细胞液
5、，则加水后必须充分搅拌，目的是充分搅拌，目的是_。DNA主要存在于主要存在于 鸡血细胞的细胞核内鸡血细胞的细胞核内 柠檬酸钠柠檬酸钠 使鸡血细胞充分破碎完全释放出使鸡血细胞充分破碎完全释放出DNA (4)加入洗涤剂后，动作要加入洗涤剂后，动作要_，否则容易产生大量的，否则容易产生大量的_，不，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免_ _，导致，导致DNA分子不能形成分子不能形成_。(5)用酒精浓缩和沉淀用酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的体积分数为时，所用的体积分数为95%的酒精必须的酒精必须_后才能使用，冷却
6、酒精与含有后才能使用，冷却酒精与含有DNA的氯化钠溶液的体积比是的氯化钠溶液的体积比是11。(6)常温下，二苯胺试剂要常温下，二苯胺试剂要_，否则会影响鉴定的效果。，否则会影响鉴定的效果。轻缓、柔和轻缓、柔和 泡沫泡沫加剧加剧DNA 分子的断裂分子的断裂 絮状沉淀絮状沉淀 充分预冷充分预冷 现配现用现配现用 归纳整合归纳整合 1实验中两次加入蒸馏水的目的实验中两次加入蒸馏水的目的第一次加入是在第一次加入是在“破碎细胞，获取含破碎细胞，获取含DNA的滤液的滤液”步骤中，加入的目的是使鸡步骤中，加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破；第二次加入是在血细胞吸水涨破；第二次加入是在“去除滤液中的杂质去除滤液中
7、的杂质”步骤中，加入的目的是稀步骤中，加入的目的是稀释释NaCl溶液，使溶液，使DNA逐渐析出。逐渐析出。2实验中三次使用实验中三次使用2 mol/L的的NaCl溶液的目的溶液的目的实验中有三次使用实验中有三次使用2 mol/L/L的的NaClNaCl溶液，作用均为溶解溶液，作用均为溶解DNADNA。第一次是向滤液。第一次是向滤液中加入中加入NaClNaCl，使，使NaClNaCl溶液的物质的量浓度为溶液的物质的量浓度为2 mol/2 mol/L；第二次和第三次均是直接用；第二次和第三次均是直接用物质的量浓度为物质的量浓度为2 mol/L的的NaCl溶液溶解含溶液溶解含DNA的丝状物。的丝状物
8、。 3.实验中四次过滤的比较实验中四次过滤的比较项目项目第一次过滤第一次过滤第二次过滤第二次过滤第三次过滤第三次过滤第四次过滤第四次过滤滤液中滤液中含含DNA的核物质的核物质DNA溶于溶于0.14mol/L的的NaCl溶液的杂质溶液的杂质DNA纱布上纱布上细胞膜、核膜等残细胞膜、核膜等残片片不溶于不溶于2 mol/L的的NaCl溶液的杂质溶液的杂质含含DNA的黏稠物的黏稠物不溶于不溶于2 mol/L的的NaCl溶液的杂质溶液的杂质过滤前加入的过滤前加入的物质物质蒸馏水蒸馏水NaCl溶液溶液蒸馏水蒸馏水NaCl溶液溶液过滤过滤目的目的去除细胞膜、核膜去除细胞膜、核膜等杂质等杂质去除不溶于去除不溶
9、于2 mol/L的的NaCl溶液的杂质溶液的杂质去除溶于去除溶于0.14 mol/L的的NaCl溶液的杂质溶液的杂质去除不溶于去除不溶于2 mol/L的的NaCl溶液的杂质溶液的杂质 思维探究思维探究 下面为下面为“DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定”实验的一些重要操作示意图，据图回答下列有实验的一些重要操作示意图，据图回答下列有关该实验的问题：关该实验的问题：(1)用箭头和字母表示出正确的操作顺序。用箭头和字母表示出正确的操作顺序。提示：提示：CBEDA。(2)上图上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，那么分别是什么？步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，那么分别是什么？提示：提示：C的目的是
10、加速鸡血细胞的破裂；的目的是加速鸡血细胞的破裂；E的目的是降低的目的是降低NaCl溶液的浓度，使溶液的浓度，使DNA析出。析出。(3)图图A步骤中所用酒精必须经充分冷却才能使用，该步骤的目的是什么？步骤中所用酒精必须经充分冷却才能使用，该步骤的目的是什么？提示：提示：提取含杂质少的提取含杂质少的DNA。(4)为鉴定为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为中所得到的丝状物的主要成分为DNA，说出鉴定方法，并预测结果，说出鉴定方法，并预测结果和结论。和结论。提示：提示：可滴加二苯胺试剂并沸水浴。如果出现蓝色，则该丝状物的主要成分为可滴加二苯胺试剂并沸水浴。如果出现蓝色，则该丝状物的主要成分为DNA。
11、教材深挖教材深挖 1教材选修教材选修1P55“旁栏思考题旁栏思考题”：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？提示：提示：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和细胞膜和核膜的破裂核膜的破裂)，从而释放出，从而释放出DNA。2教材选修教材选修1P55“旁栏思考题旁栏思考题”：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？提示：提示
12、：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的的释放；食盐的主要成分是主要成分是NaCl，有利于，有利于DNA的溶解。的溶解。命题点一命题点一DNA的粗提取与鉴定的实验原理的粗提取与鉴定的实验原理 1(2019河北衡水校级月考河北衡水校级月考)下列关于下列关于“DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定”实验的原理的实验的原理的叙述，正确的是叙述，正确的是()A可用猪血作为实验材料，原因是猪血红细胞的细胞核中可用猪血作为实验材料，原因是猪血红细胞的细胞核中DNA含量多含量多B利用利用“DNA在在2 mol/L的的NaCl溶液中溶解度最低，
13、易析出溶液中溶解度最低，易析出”的特性提取的特性提取DNAC利用利用“DNA不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质可溶于酒精不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质可溶于酒精”的特性提纯的特性提纯DNAD利用利用“DNA与二苯胺作用而显现紫色与二苯胺作用而显现紫色”的特性鉴定的特性鉴定DNA解析解析猪血红细胞不含细胞核和各种细胞器，猪血红细胞不含细胞核和各种细胞器，A A错误；错误；DNADNA在在2 mol/2 mol/L的的NaCl溶液中溶解度较高，溶液中溶解度较高，B错误；利用错误；利用“DNA不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质可溶不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质可溶于酒精于酒精”的特性提纯的特性提纯D
14、NA，C正确；在沸水浴条件下，正确；在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝与二苯胺反应呈现蓝色，色，D错误。错误。 命题点二命题点二DNA粗提取与鉴定的实验设计粗提取与鉴定的实验设计2(2019江苏南通模拟江苏南通模拟)在利用鸡血进行在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定”的实验中，的实验中，下列叙述正确的是下列叙述正确的是()A用蒸馏水将用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至溶液浓度调至0.14mol/L，滤去析出物，滤去析出物B调节调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质C将丝状物溶解在将丝状物溶解在2 mol/L NaCl
15、溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色D由于由于DNA对高温耐受性较差，故需向对高温耐受性较差，故需向DNA滤液中加入冷酒精滤液中加入冷酒精B解析解析DNADNA在浓度为在浓度为0.14 mol/0.14 mol/L的的NaCl溶液中的溶解度最低，因此用蒸馏水将溶液中的溶解度最低，因此用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至溶液浓度调至0.14 mol/L/L，DNADNA析出，过滤去除溶液中的杂质，析出，过滤去除溶液中的杂质，A A错误；根据错误；根据DNADNA和蛋白质的溶解度以及对酶的耐受性不同，调节和蛋白质的溶解度以及对酶的耐受性不同，调节NaClNaCl溶液浓度或加入木瓜
16、蛋白溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质，酶，都可以去除部分杂质，B B正确；将丝状物溶解在正确；将丝状物溶解在2 mol/2 mol/L的的NaCl溶液中，加入二溶液中，加入二苯胺试剂后要经沸水浴加热后才能呈现蓝色，苯胺试剂后要经沸水浴加热后才能呈现蓝色，C错误；由于错误；由于DNA不溶于酒精，细胞不溶于酒精，细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此需向中的某些蛋白质溶于酒精，因此需向DNA滤液中加入冷酒精以进一步纯化滤液中加入冷酒精以进一步纯化DNA，D错误。错误。 3. 如图为如图为“DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定”实验的相关操作。分析回答：实验的相关操作。分析回答：(1)图中实验材
17、料图中实验材料A可以是可以是_等，研磨前加入的等，研磨前加入的B应该是应该是_。(2)通过上述所示步骤得到滤液通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入后，再向滤液中加入2 mol/L的的NaCl溶液的目溶液的目的是的是_，再过滤得到滤液，再过滤得到滤液D，向滤液，向滤液D中加入蒸馏水的目的是中加入蒸馏水的目的是_。洋葱洋葱(菜花菜花) 洗涤剂和食盐洗涤剂和食盐 使使DNA溶解溶解 使使DNA(溶解度下降而沉淀溶解度下降而沉淀)析出，除去可溶性杂质析出，除去可溶性杂质 (3)在在“DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放丝状物分别
18、放入体积为入体积为2 mL的的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得如表所示的种溶液中，经搅拌后过滤，获得如表所示的4种滤液，含种滤液，含DNA最最少的是滤液少的是滤液_。1B液中液中搅拌、研磨后过滤搅拌、研磨后过滤滤液滤液E22 mol/L的的NaCl溶液中溶液中搅拌后过滤搅拌后过滤滤液滤液F30.14 mol/L的的NaCl溶液中溶液中搅拌后过滤搅拌后过滤滤液滤液G4冷却的冷却的95%的酒精溶液中的酒精溶液中搅拌后过滤搅拌后过滤滤液滤液HH 解析解析(1)用洋葱、菜花等破碎细胞时，加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂可用洋葱、菜花等破碎细胞时，加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂可以溶解细胞膜，有利于以溶
19、解细胞膜，有利于DNA的释放，食盐的主要成分是的释放，食盐的主要成分是NaCl，有利于，有利于DNA的溶的溶解。解。(2)在含有在含有DNA的滤液中，加入的滤液中，加入2 mol/L/L的的NaClNaCl溶液，可以使溶液，可以使DNADNA溶解而杂质析溶解而杂质析出；在滤液出；在滤液D D中加入蒸馏水，当中加入蒸馏水，当NaClNaCl溶液浓度为溶液浓度为0.14 mol/0.14 mol/L时，时，DNA溶解度最小而溶解度最小而析出，除去可溶性杂质。析出，除去可溶性杂质。(3)在滤液在滤液E中，只是除去了部分杂质，则含中，只是除去了部分杂质，则含DNA较多；在滤液较多；在滤液F中，除去了较
20、中，除去了较多的蛋白质等，则含多的蛋白质等，则含DNA最多；在滤液最多；在滤液G中，因中，因DNA析出，则含析出，则含DNA较少；在滤液较少；在滤液H中，因中，因DNA不溶于体积分数为不溶于体积分数为95%的冷酒精溶液，则含的冷酒精溶液，则含DNA最少。最少。1细胞内细胞内DNA复制的条件和复制的条件和PCR扩增的原理扩增的原理(1)细胞内细胞内DNA复制的条件复制的条件考点二多聚酶链式反应扩增考点二多聚酶链式反应扩增DNA片段片段原料原料4种种_模板模板2条条DNA母链母链酶酶解旋酶和解旋酶和_能量能量由由ATP提供提供引物引物使使DNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的_开始连接脱氧核苷
21、酸开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸 DNA聚合酶聚合酶 3端端 (2)PCR扩增的原理扩增的原理多聚酶链式反应，即多聚酶链式反应，即_技术，是一种技术，是一种_迅速扩增迅速扩增DNA的技术。的技术。DNA _原理，即：原理，即：子链的延伸方向为从子链的延伸方向为从_到到_。条件：条件：DNA模板、分别与两条模板相结合的模板、分别与两条模板相结合的_、四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、耐热的耐热的_、稳定的、稳定的_、能自动调控温度的温控设备。、能自动调控温度的温控设备。PCR体外体外 热变性热变性 变性变性 冷却冷却 5端端 3端端 两个引物两个引物 Taq DNA聚合酶聚合酶缓冲液缓冲液
22、2PCR的反应过程和实验操作的反应过程和实验操作(1)PCR的反应过程的反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为_三步。三步。变性：变性：当温度上升到当温度上升到_以上时，双链以上时，双链DNA解旋为单链。解旋为单链。复性：复性：当温度下降到当温度下降到50 左右时，两种引物通过左右时，两种引物通过_与两条单链与两条单链DNA结合。结合。延伸：延伸：当温度上升到当温度上升到72 左右时，在左右时，在_的作用下，溶液中的四种的作用下，溶液中的四种脱氧核苷酸通过脱氧核苷酸通过_合成新的合成新的DNA链。链。变性、复性和延伸变性、复性和延伸 90
23、 碱基互补配对碱基互补配对 DNA复合酶复合酶 碱基互补配对碱基互补配对 (2)实验用具与操作实验用具与操作实验用具实验用具(a)PCR仪：能自动调控仪：能自动调控_，实现，实现DNA的扩增。如果没有的扩增。如果没有PCR仪，可用仪，可用3个个_代替。代替。(b)微量离心管：总容积为微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行，实际上是进行_。(c)微量移液器：用于向微量离心管中转移微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。配方中的液体。温度温度 恒温水浴锅恒温水浴锅 PCR_反应的场所反应的场所 实验操作程序实验操作程序准备：按照准备：按照PCR反应体系配方将需要的试剂摆放在实
24、验桌上反应体系配方将需要的试剂摆放在实验桌上移液：用移液：用_按照配方向微量离心管中依次加入各组分按照配方向微量离心管中依次加入各组分_：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀离心：离心：反应：将离心管放入反应：将离心管放入_中进行反应中进行反应微量移液器微量移液器 混合混合 将微量离心管放在离心机上，离心约将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，目的是目的是_使反应液集中在离心管底部使反应液集中在离心管底部 PCR仪仪 3操作提示与操作提示与DNA含量的测量含量的测量(1)操作提示操作提示为避免外源为避免外
25、源DNA等因素的污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进等因素的污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行行_。缓冲液和酶应分装成小份，并在缓冲液和酶应分装成小份，并在_条件下储存。条件下储存。每添加一种试剂后，移液器上的枪头必须每添加一种试剂后，移液器上的枪头必须_。混合均匀后要混合均匀后要_处理，使反应液集中在离心管底部。处理，使反应液集中在离心管底部。(2)DNA含量的测定含量的测定原理：原理：DNA在在_波段有一强烈的吸收峰。波段有一强烈的吸收峰。计算公式：计算公式：DNA含量含量(g/mL)50_。高压灭菌高压灭菌 20 更换更换 离心离心 260 nm的紫外线的紫外线 (2
26、60 nm的读数的读数)稀释倍数稀释倍数 归纳整合归纳整合 1DNA的复制方向的复制方向图图1 脱氧核糖属于五碳糖，每个脱氧核糖上有脱氧核糖属于五碳糖，每个脱氧核糖上有5个碳原子，与每个碳原子相连接的个碳原子，与每个碳原子相连接的化学基团并不完全相同。为区别不同的碳原子，科学家给每个碳原子编上了号码。化学基团并不完全相同。为区别不同的碳原子，科学家给每个碳原子编上了号码。在脱氧核糖核苷酸中，五个碳原子的编号如图在脱氧核糖核苷酸中，五个碳原子的编号如图1所示。在所示。在DNA单链中将磷酸基团的单链中将磷酸基团的末端称为末端称为5端，将含有羟基端，将含有羟基(OH)的末端称为的末端称为3端，如图端
27、，如图2所示：所示：图图2DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从，而只能从3端延伸端延伸DNA链，所以链，所以DNA的的合成方向总是从子链的合成方向总是从子链的5端向端向3端延伸。端延伸。2细胞内细胞内DNA复制和细胞外复制和细胞外PCR扩增的比较扩增的比较DNA复制复制PCR扩增扩增不不同同点点场所场所活细胞内活细胞内细胞外细胞外能量能量ATP提供能量提供能量不需不需ATP提供能量提供能量酶酶解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶耐热耐热DNA聚合酶聚合酶(Taq DNA聚聚合酶合酶)是否有是否有RNA合成合成伴有伴有RNA合成，产生引合成，产生引物物无无RNA合成，
28、需加入两种引物合成，需加入两种引物是否需缓冲液是否需缓冲液不需缓冲液不需缓冲液严格配制严格配制10倍浓缩的扩增缓冲倍浓缩的扩增缓冲液液设备设备无无严格控制温度变化的温控设备严格控制温度变化的温控设备相同点相同点原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(含含A、T、G、C)复制原理复制原理严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制模板模板以以DNA为模板为模板引物引物都需要与两条模板链相结合的两种引物都需要与两条模板链相结合的两种引物 思维探究思维探究 下图为下图为PCR技术的过程示意图，请回答：技术的过程示意图，请回答：(1)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分
29、为哪三个步骤？一般要经历三十多次循环，每次循环可分为哪三个步骤？提示：提示：变性、复制、延伸。变性、复制、延伸。(2)PCR技术需要哪些必要条件？技术需要哪些必要条件？提示：提示：PCR技术的必要条件，除了模板、原料、酶以外，至少还需要三个条技术的必要条件，除了模板、原料、酶以外，至少还需要三个条件，即液体环境、适宜的温度和引物。件，即液体环境、适宜的温度和引物。(3)根据设计，一分子根据设计，一分子DNA经经30次循环后，应得到约次循环后，应得到约230个个DNA分子，但结果只分子，但结果只有约有约210个个DNA分子。出现该现象的原因可能有哪些？分子。出现该现象的原因可能有哪些？提示：提示
30、：循环次数不够；循环次数不够；Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；系统设计聚合酶活力不够或其活性受到抑制；系统设计欠妥。欠妥。 教材深挖教材深挖 (1)教材教材P58左下角相关信息：引物的实质是什么？左下角相关信息：引物的实质是什么？DNA复制时为什么需要引复制时为什么需要引物？物？提示：提示：引物是一小段引物是一小段DNA或或RNA，它能与，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配母链的一段碱基序列互补配对，用于对，用于PCR的引物长度通常为的引物长度通常为2030个核苷酸。个核苷酸。DNA聚合酶不能从头合成聚合酶不能从头合成DNA，而只能从，而只能从3端延伸端延伸DNA链，因此链，因
31、此DNA复制需要引物。复制需要引物。(2)教材教材P63练习练习2：如果要使用：如果要使用PCR扩增一段已知的扩增一段已知的DNA序列，你打算如何设计序列，你打算如何设计引物？引物？提示：提示：PCR引物是根据需要扩增的目标引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。的碱基序列来设计的。命题点一命题点一PCR的原理与反应过程的原理与反应过程 1下列关于下列关于DNA聚合酶催化合成聚合酶催化合成DNA子链的说法，正确的是子链的说法，正确的是()A以以DNA为模板，使为模板，使DNA子链从引物的子链从引物的3端开始延伸的一种酶端开始延伸的一种酶BTaq DNA聚合酶在每次高温变性处理后都必须
32、再添加聚合酶在每次高温变性处理后都必须再添加CDNA聚合酶能特异性地复制聚合酶能特异性地复制DNA的全部序列的全部序列DTaq DNA聚合酶是从深海生态系统中发现的聚合酶是从深海生态系统中发现的A解析解析DNADNA聚合酶不能从头开始催化合成聚合酶不能从头开始催化合成DNADNA，而只能使子链从引物的，而只能使子链从引物的3 3端延端延伸，伸，A A正确；正确；TaqTaq DNA DNA聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可被反复利用，无需另聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可被反复利用，无需另外再添加，外再添加，B B错误；错误；PCRPCR扩增的是两个引物之间的固定长度的扩增的是两个引物之间的
33、固定长度的DNADNA序列，序列，C C错误；错误；TaqTaq DNA DNA聚合酶是从水生耐热细菌聚合酶是从水生耐热细菌TaqTaq中分离得到的，该菌发现于美国黄石国家公中分离得到的，该菌发现于美国黄石国家公园的一个热泉中，园的一个热泉中，D D错误。错误。 2实验室中模拟生物体内实验室中模拟生物体内DNA复制必需的一组条件是复制必需的一组条件是()耐高温的耐高温的DNA聚合酶聚合酶游离的脱氧核苷酸游离的脱氧核苷酸引物引物DNA模板模板mRNAtRNA适宜的温度适宜的温度适宜的酸碱度适宜的酸碱度解旋酶解旋酶ABC DD解析解析mRNAmRNA是翻译的模板，是翻译的模板，tRNAtRNA是翻
34、译的是翻译的“搬运工搬运工”，二者在基因的表达中，二者在基因的表达中用到，而在用到，而在PCRPCR过程中不需要。解旋酶在细胞内过程中不需要。解旋酶在细胞内DNADNA复制时用到，但在复制时用到，但在PCRPCR过程中过程中不需要，不需要，PCRPCR是通过加热来使是通过加热来使DNADNA解螺旋的。解螺旋的。 命题点二命题点二PCR的操作过程的操作过程3使用使用PCR仪的具体实验操作顺序应为仪的具体实验操作顺序应为()设计好设计好PCR仪的循环程序仪的循环程序按配方准备好各组分按配方准备好各组分用微量移液器在微量用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分离心管中依次加入各组分进行进行PCR反应
35、反应离心使反应液集中在离心管底部离心使反应液集中在离心管底部A BC D解析解析使用使用PCRPCR仪的操作步骤一般分为准备仪的操作步骤一般分为准备( (包括配制配方及将各配方放于实验包括配制配方及将各配方放于实验台上台上) )、移液、混合、离心、反应。、移液、混合、离心、反应。PCRPCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。程序就可以进行反应了。 4(2019广东湛江期中广东湛江期中)下列关于下列关于PCR操作过程的叙述错误的是操作过程的叙述错误的是()APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须实验中使用
36、的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌进行高压蒸汽灭菌BPCR缓冲液和酶应分装成小份，在缓冲液和酶应分装成小份，在20储存储存CPCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换必须更换解析解析PCRPCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭茵，须进行高压蒸汽灭茵，A A正确；正确；PCRPCR缓冲液和酶
37、应分装成小份，在缓冲液和酶应分装成小份，在2020储存，储存，B B正正确；确；PCRPCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能使缓所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能使缓冲液中稳定性较差的成分和酶的活性不被破坏，冲液中稳定性较差的成分和酶的活性不被破坏，C C错误；在微量离心管中添加反应错误；在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，D D正确。正确。 1酵母和菜花均可作为提取酵母和菜花均可作为提取DNA的材料的材料( )2DNA既溶于既溶于2 mol/L Na
38、Cl溶液也溶于蒸馏水溶液也溶于蒸馏水( )3向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物( )4利用利用DNA溶于酒精，而蛋白质不溶于酒精，可将溶于酒精，而蛋白质不溶于酒精，可将DNA与蛋白质分离与蛋白质分离 ( )5利用高温能使蛋白质变性，却对利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，可将没有影响的特性，可将DNA与蛋白质分与蛋白质分离离( )课堂小结内化体系 6在溶有在溶有DNA的物质的量浓度为的物质的量浓度为2 mol/L的氯化钠溶液中缓缓加入蒸馏水，轻的氯化钠溶液中缓缓加入蒸馏水，轻轻搅拌后过滤，取滤液进行以后的实验轻搅拌
39、后过滤，取滤液进行以后的实验( )7在在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分与蛋白质分离离( )8PCR反应所需要的引物只是反应所需要的引物只是RNA( ) 9.PCR反应所需要的原料是核糖核苷酸反应所需要的原料是核糖核苷酸( )10PCR反应所需要的酶在反应所需要的酶在60 会变性会变性( )11PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行反应需要在一定的缓冲溶液中进行( ) 1DNA粗提取与鉴定的实验选材粗提取与鉴定的实验选材(1)选用鸡血作实验材料的原因：鸡血中选用鸡血作实验材料的原因：鸡血中DNA含量丰富，价格便宜，材料
40、易含量丰富，价格便宜，材料易得；鸡血细胞极易吸水涨破。得；鸡血细胞极易吸水涨破。(2)哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和细胞器，不含哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和细胞器，不含DNA，不适合作本实验的，不适合作本实验的材料。材料。(3)若使用植物细胞作为实验材料若使用植物细胞作为实验材料(以洋葱为例以洋葱为例)，破碎细胞获取含，破碎细胞获取含DNA的滤液的的滤液的方法：在切碎的洋葱中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分地搅拌和研磨，然后过滤方法：在切碎的洋葱中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分地搅拌和研磨，然后过滤收集研磨液。收集研磨液。2DNA的粗提取与鉴定过程中的相关试剂的粗提取与鉴定过程中的相关试剂(1
41、)柠檬酸钠：在用血液作为实验材料时使用，作为抗凝剂，防止血液凝固。柠檬酸钠：在用血液作为实验材料时使用，作为抗凝剂，防止血液凝固。(2)洗涤剂：在用植物细胞作为实验材料时使用，能够瓦解细胞膜，利于洗涤剂：在用植物细胞作为实验材料时使用，能够瓦解细胞膜，利于DNA的释放。的释放。(3)食盐：加速核蛋白解聚，游离出食盐：加速核蛋白解聚，游离出DNA分子。分子。(4)酒精：体积分数为酒精：体积分数为95%的冷却的酒精，可抑制核酸水解酶活性，防止的冷却的酒精，可抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；降低分子运动，使降解；降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温还利于增加易形成沉淀析出；低温还利于增加D
42、NA分子的柔韧分子的柔韧性，减少断裂。性，减少断裂。(5)二苯胺试剂：要现配现用，否则会影响鉴定效果。鉴定时，溶液蓝色的深浅二苯胺试剂：要现配现用，否则会影响鉴定效果。鉴定时，溶液蓝色的深浅与溶液中与溶液中DNA含量的多少有关。含量的多少有关。3PCR技术的三点提醒技术的三点提醒(1)PCR反应需要适宜但不同于细胞内反应需要适宜但不同于细胞内DNA复制的条件，如复制的条件，如PCR反应不需要添反应不需要添加解旋酶和加解旋酶和ATP，但需要添加耐热的，但需要添加耐热的DNA聚合酶以及能够人为控制温度和复制周期聚合酶以及能够人为控制温度和复制周期等。等。(2)体内体内DNA复制与复制与PCR反应的
43、主要不同点：反应的主要不同点：PCR过程需要的引物多为人工过程需要的引物多为人工合成的合成的DNA单链或单链或RNA，其长度通常为，其长度通常为2030个核苷酸；个核苷酸；PCR过程中过程中DNA的解的解旋不是依靠解旋酶完成的，而是通过对反应温度的控制来完成的。旋不是依靠解旋酶完成的，而是通过对反应温度的控制来完成的。(3)PCR利用了利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制的热变性原理，通过控制温度来控制DNA双链的解聚与结双链的解聚与结合。合。PCR技术中的温度控制是关键，解答此类问题要清楚技术中的温度控制是关键，解答此类问题要清楚PCR过程中的温度变化。过程中的温度变化。随堂演练巩固提升课时作业课时作业(三十四三十四)谢谢观看