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1、实实 验验 一一质粒质粒DNADNA的提取及鉴定的提取及鉴定l复制子：一段具有特殊结构的复制子：一段具有特殊结构的DNADNA序列，使与序列，使与之结合的外源基因复制。之结合的外源基因复制。l可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反应。应。l限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基因的插入。因的插入。l适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。是是染色体外小型的双链环状的染色体外小型的双链环状的DNADNA，常用载
2、体之一，常用载体之一u自我复制自我复制u具有合适的限制酶切位点具有合适的限制酶切位点u筛选标记筛选标记 可编码某些遗传性状可编码某些遗传性状 如抗药性、耐受重金属、如抗药性、耐受重金属、产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外的特性的特性u高拷贝数高拷贝数u小分子量小分子量1-200Kb 1-200Kb u高稳定性高稳定性1.1.3 1.1.3 质粒提取一般步骤质粒提取一般步骤1. 细菌培养物的生长2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化 根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体和线性染色体DNA在在拓扑学上的差异来分离质粒拓扑
3、学上的差异来分离质粒DNA。 在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。 当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA1.1.3 1.1.3 质粒提取质粒提取含质粒载体（含质粒载体（pET28apET28a）和含目的基因质粒）和含目的基因质粒（pEGFP-N3pEGF
4、P-N3）的大肠杆菌）的大肠杆菌DH5aDH5a溶液溶液I I 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris.HCl）（pH8.0） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8 .0） 溶液溶液IIII 0.4 mol/L NaOH， 2% SDS（用前等体积混合）（用前等体积混合） 溶液溶液IIIIII 5 mmol/L 乙酸钾 ， 冰乙酸 ，H2O 苯酚：氯仿苯酚：氯仿（2525：2424） 氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇( (2424：1)1) 无水乙醇，无水乙醇， 70%70%乙醇乙醇(-20C保存) TETE缓冲液缓冲液: 10mmol/L Tris.
5、HCl, 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 胰胰RNARNA酶酶 1 1、细菌培养和收集、细菌培养和收集 将将3ml3ml含含KanKan的的LBLB液体培养基加入到试管中，液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，接入含质粒的大肠杆菌，3737振荡培养过振荡培养过夜。（已完成）夜。（已完成） 取取2.5mL2.5mL培养物倒入微量离心管（培养物倒入微量离心管（EPEP管）管）中中, 10000rpm, 10000rpm离心离心1min1min，吸去培养液。，吸去培养液。2 2、细菌裂解及质粒的提取、细菌裂解及质粒的提取 将细胞沉淀悬浮于将细胞沉淀悬浮于100ul100ul溶液溶液
6、I I中中, ,充分震荡混匀。充分震荡混匀。 加加200ul200ul溶液溶液IIII( (新鲜配制新鲜配制),),盖紧管盖盖紧管盖, ,轻轻混匀轻轻混匀内容物内容物, ,将离心管放将离心管放冰上冰上5min5min。 加加150ul150ul溶液溶液III(III(冰上预冷冰上预冷),),盖紧管口盖紧管口, ,轻轻颠轻轻颠倒倒数次使混匀。数次使混匀。冰上冰上放置放置10min10min。 12000rpm12000rpm离心离心10min,10min,将上清转至另一将上清转至另一EPEP管管（作（作好标记）好标记）中。中。 向上清中加入向上清中加入等体积（等体积（450ul450ul）酚酚:
7、 :氯仿氯仿(1:1) (1:1) （注意下层是有机相）（注意下层是有机相）, ,反复混匀。反复混匀。 12000rpm,12000rpm,离心离心2 2分钟分钟, ,将上清将上清小心地小心地转移到另转移到另一离心管一离心管（标记！）（标记！）中中 加入加入等体积（等体积（450ul450ul）氯仿氯仿: :异戊醇异戊醇 (24:1),(24:1),反复混匀。反复混匀。 12000rpm,12000rpm,离心离心2 2分钟，分钟，取上清液于新的取上清液于新的EPEP管管中。中。3 3、质、质 粒粒 的的 纯纯 化化4 4、质粒的浓缩、质粒的浓缩 加入加入2 2倍体积（倍体积（900ul900
8、ul）无水乙醇）无水乙醇, ,混匀后混匀后, ,室温放置室温放置10-15min10-15min。 12000rpm12000rpm离心离心5 5分钟，分钟，倒去上清液倒去上清液, ,把离心把离心管倒扣在吸水纸上管倒扣在吸水纸上, ,吸干液体。吸干液体。 用用1ml 1ml 70%70%乙醇乙醇洗涤质粒洗涤质粒DNADNA沉淀沉淀, , 振荡并振荡并离心离心, 12000rpm, 12000rpm离心离心2 2分钟，倒去上清液分钟，倒去上清液, , 空气中干燥空气中干燥5 510min10min。5 5、质粒的溶解和保存、质粒的溶解和保存加加20ul TE20ul TE缓冲液缓冲液, ,其中含
9、有其中含有100ug/ml100ug/ml的胰的胰RNARNA酶酶, ,使使DNADNA完全溶解。完全溶解。-20-20保存保存。6 6、质粒、质粒DNADNA的电泳检测的电泳检测（1 1）琼脂糖凝胶的制备）琼脂糖凝胶的制备 每每4 4人人制备一块琼脂糖凝胶（制备一块琼脂糖凝胶（9 9个泳道）个泳道） 0.20.2克琼脂糖克琼脂糖+20+20毫升毫升TAETAE缓冲液，电炉融缓冲液，电炉融胶（胶（充分溶解充分溶解），稍微冷却加），稍微冷却加2 2 lgoldviewnalgoldviewna显示液，倒在电泳胶槽中，显示液，倒在电泳胶槽中，使胶凝固使胶凝固(20min)(20min)。（2 2）
10、 每人每人2 2个样品，个样品，pET28apET28a和和pEGFP-N3pEGFP-N3各一个各一个。 取取3 3 l l（记住自己（记住自己点样位置）点样位置）。 接通电泳仪和电泳槽的电源接通电泳仪和电泳槽的电源( (注意正负极注意正负极) )（+ +） 恒压恒压150V,150V,电泳电泳10-2010-20分钟分钟 紫外灯下观察并记录结果紫外灯下观察并记录结果( (对面实验室拍照片对面实验室拍照片) ) 分析结果。分析结果。l溶液溶液I I加入后充分悬浮加入后充分悬浮l溶液溶液IIII一次性加入后轻柔地颠倒混匀一次性加入后轻柔地颠倒混匀l溶液溶液IIIIII加入后轻柔地颠倒混匀加入后
11、轻柔地颠倒混匀l酚抽提后小心吸取上清酚抽提后小心吸取上清l无水乙醇和无水乙醇和70%70%乙醇不要弄混乙醇不要弄混l微量加样器的正确使用微量加样器的正确使用思思 考考 题题 分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的特点是什么？特点是什么？ 分离基因组分离基因组DNADNA和质粒和质粒DNADNA有哪些不同之处？有哪些不同之处？ 核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？是什么？ 在在TETE缓冲液中为什么要加入缓冲液中为什么要加入EDTAEDTA？ 纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染的话，对纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染的话，对它的后期操作有何影响？它的后期操作有何影响？ 有哪些因素影响核酸的沉淀？有哪些因素影响核酸的沉淀？ 下下 次次 实实 验验质粒质粒DNADNA的酶切鉴定的酶切鉴定及电泳检测及电泳检测