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1、实验实验 双缩脲法测定蛋白质浓度双缩脲法测定蛋白质浓度实验目的实验目的1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习蛋白质含量测定的原理和方法3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法原理：原理：物质的电子结构电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。根据物质对光的吸收特征和吸收强度吸收特征和吸收强度，对物质进行定性定性和定量和定量的分析方法，常用紫外可见分光光度法。 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光分光光度法分光光度法
2、定性分析与定量分析的基础定性分析与定量分析的基础 物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收A max在一定的实验条件下，在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质物质对光的吸收与物质的浓度成正比。的浓度成正比。A C增增大大定性分析基础定性分析基础定量分析基础定量分析基础I0I参比参比样品样品入射光入射光 I0透射光透射光 Ip 一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。p 在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。LambertBeer定律定律A=CLT（透射比）=I/I0=10-CLlg(1/T)= CLA为吸光度；为吸收系数；C C为溶液浓度；L
3、 L为溶液光程的厚度应用（1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。 （3）比较吸光度的比值 纯DNA8 . 1280260nmnmAA1.标准曲线法标准曲线法p配制一系列不同浓度的标准溶液（至少5个）按测定管同样方法处理显色，在选定的波长分别测定各管的吸光度（A），以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度（C）为横坐标，制作标准曲线。p 根据样品的A从标准曲线上查得样品含量，再计算出样品的浓度。常用方法常用方法标准系列标准系列未知样品未知样品 标准曲线与样品的测定条件必须一致。标准曲线与样品的测定条件必须一致。 待测样品的浓度必须在
4、标准曲线范围内。待测样品的浓度必须在标准曲线范围内。2. 标准管法标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。3. 摩尔吸光系数法摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。）分光光度计的使用分光光度计的使用单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计 1722型分光光度计的外形2.仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0
5、ABS(零吸光度)“0%T”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 打开样品室盖，将参比溶液倒入比色皿中放入比色皿架靠近测定者一端位置，并将样品溶液倒入比色皿中放入比色皿架的其它位置，盖好样品室盖。 拉动比色皿架拉杆一小格使比色皿架挡住光路，按“0%T”键调透射比为零 推入比色皿架使参比溶液位于光路中，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式A，此时应显示为0，如果不是则按“100%T”再调A零 将被测溶液拉入
6、光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿洗净比色皿，并盖好盖布。在签名本上签名。返回光路返回光路返回美谱达美谱达V-1100D可见分光光度计可见分光光度计测量前的准备测量前的准备开机自检：确认仪器光路中无阻挡物，关上样品室仪器电源开始自检预热：仪器自检完成后进入预热状态，预热时间需在30分钟以上使用说明使用说明测量模式选择：按MODE键可切换测量模式设置波长：转动波长旋钮可设置测试波长，波长值可从显示器实时读取校准零位：按可校准零位校准100%T：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按可校准100%T测量吸光度测量吸光度第一步：按MODE键选定模式为“A
7、”模式第二步：旋转波长旋钮到测试波长第三步：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按校准100%T第四步：将放有“样品”的样品槽置于光路中，读取吸光度值752型分光光度计美谱达美谱达UV-1200紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计蛋白质含量测定的原理和方法蛋白质含量测定的原理和方法微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋
8、白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 消消化化CO2+SO2+H2O+NH3 +浓浓H2SO4NNH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸蒸馏馏H2O+Na2SO4+NH3(NH4)2SO4+NaOH吸吸收收NH3+H3BO3NH4HB4O7+H2O滴滴定定NH4HB4O7+HCl+H2ONH4Cl+H3BO3氮的总量测定氮的总量测定凯氏定氮法凯氏定氮法原理原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋
9、白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-10mg双缩脲法双缩脲法540 nmFolin-酚试剂法酚试剂法(Lowry法法) Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高（20-250g）、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 紫外分光光度法紫外分光光度法 由于蛋白质分子中酪氨
10、酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 总蛋白定量分析总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）二辛可宁酸、二羧基二喹啉）准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/mL；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20g/mL快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微
11、孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝 基本原理：基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高10100g （比Lowry法灵敏4倍）。 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量PROTE
12、IN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定紫外吸收法紫外吸收法双缩脲法双缩脲法Folin-酚法酚法考马斯亮蓝考马斯亮蓝法法检测检测波长波长280 nm540 nm650 nm595 nm检测检测范围范围0.1-1.0 mg1-10 mg25-250g10-100 g 繁琐繁琐程度程度简便较简便较简便较简便应用应用纯度高样品快速但不十分精确受多种因素干扰干扰较少 本次实验采用双缩脲法测定蛋白质含量本
13、次实验采用双缩脲法测定蛋白质含量一、操作步骤一、操作步骤1.取15支试管，按下表编号、加试剂（做2个平行组）管号0123456样品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.64.86.02mg/mL牛血清白蛋白体积(mL)00.30.61.21.82.43.0待测液体积(mL)3.0*（取2个不同体积）蒸馏水(mL)3.02.72.41.81.20.600OD5402.各管混匀混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL，37oC反应30min。3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。二、结果处理二、结果处理1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的
14、计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。三、注意事项三、注意事项1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。3.用坐标纸绘制标准曲线，注明轴名称及单位。4.比色杯的使用微量移液器的使用微量移液器的使用返回吸液：吸液：调好量程后，用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点，吸取所需液体。排液：排液：接着将按钮按至第一停点，排出液体排出残液：排出残液：稍停片刻继续按按钮至第二停点，吹出残余的液体。最后松开按钮。l设定量程时，切忌使移液器量程旋钮超出其标示的最小和最大量程。l在将枪头套上移液器时，切忌使劲地用枪砸枪头盒。 正确的方法是将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用稍微用力左右微微转动力左右微微转动即可使其紧密结合。l吸液时，要轻推轻吸要轻推轻吸，切忌将样品吸入移液器腔内。当移液枪头里有液体时，切忌将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。l使用完毕，把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧，竖直挂在移液枪架上。移液器使用移液器使用注意事项注意事项