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1、Company LogoCompany Logo天然天然产产物抗物抗氧氧化活性化活性测测定方法定方法抗氧化的两种定义抗氧化的两种定义食品体系中：抗氧化是能够阻止或延缓食品的氧化，用于提高食品的稳定性及延长储藏性生物体系中：能够明显阻止和延缓被氧化物质的氧化，其中被氧化物质包括脂类、蛋白类、糖类以及DNA抗抗氧氧化的天然化的天然产产物物 抗抗氧氧化活性化活性 抗抗氧氧化能力化能力常用的抗氧化能力评价方法: 1、对底物脂质过氧化抑制能力 2、对特定的自由基的清除能力 3、对底物的还原能力带来问题：各有特色各有特色各有优势各有优势各有局限各有局限无法无法正常评价正常评价的原因：的原因：1)抗氧化活性
2、的化学测定方法无法真实模拟生理环境，没有考虑药物跨膜进入细胞、药物吸收及其与载体或酶等生物大分子之间的相互作用 2)体内新陈代谢作用大大增加了活性物质抗氧化能力的不确定性，未考虑代谢毒性及生物有效利用性 3)生物体抗氧化反应途径多样复杂，各体系间相互作用 4)抗氧化剂与生物体液一般是混合的，其中每一种物质对不同测量方法的贡献不同 5)测定的样品大多为植物提取物，成分复杂，其抗氧化作用无法用单一的机制解释 6)抗氧化活性还受很多因素如在水相和有机相间分配效应、氧化条件和环境以及氧化底物物理状态等的影响天然天然产产物中抗物中抗氧氧化的物化的物质质抗抗氧氧化活性化活性研研究模型究模型体外模型体外模型
3、Diagram 2Diagram3Diagram 2Diagram 3细细胞胞损伤损伤模型模型体体内内模型模型体外测定方法分类体外测定方法分类1、抗脂质氧化、抗脂质氧化2、清除和抑制自由基、清除和抑制自由基3、测定还原能力、测定还原能力4、其他方法、其他方法测定方法测定方法抗脂质氧化类型检测方法抗脂质氧化类型检测方法v基本原理：基本原理：脂质中的不饱和脂肪酸自动氧化，生成不稳定的氢过氧化物，氢过氧化物继续分解形成短碳链的醛、酮、酸等小分子化合物。抗氧化剂的加入可以延缓氢过氧化物及其分解产物的形成，由此可测得抗氧化活性。v常见方法：常见方法：过氧化值(peroxide value，PV)法共轭二
4、烯过氧化物法硫氰酸铁法(ferric thioeyanate method，FTC)硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，TBA)2，4-二硝基苯肼法克雷斯实验法(Kreis test)茴香胺值(anisidine value)抗脂质氧化类型检测方法抗脂质氧化类型检测方法v测定氧化前期的有PV法/共轭二烯过氧化物法/FTC法v测定氧化后期的有TBA、克雷斯实验法/茴香胺值法抗脂质氧化方法原理抗脂质氧化方法原理v常见常见清除和抑制自由基方法清除和抑制自由基方法v基本原理：基本原理：体内自由基过剩，会对机体产生损伤。通过测定抗氧化剂清除自由基的能力来评价抗氧化活性AA.自由基+氧
5、化体系抗氧化物质A激发荧光自由基体系A产生抗氧化物质v常见方法：常见方法： 1、ABTS、DPPH法、DMPD法、Fremy自由基和galvinoxyl法 2、氧自由基吸收能力(ORAC)法、清除抗氧化能力(TRAP)法、二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法、总氧自由基清除能力(TOSC)法、化学发光法、藏花素漂白法、B一胡萝卜素漂白法、总氧自由基清楚能力（TOSC）自由基的分类自由基的分类涉及到总抗氧化性测定的方法涉及到总抗氧化性测定的方法v清除抗氧化能力(TRAP)法v氧自由基吸收能力(ORAC)法v二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法v总氧自由基清楚能力（TOSC）v藏花素漂白法TR
6、AP法和法和ORAC法法v 两种方法均利用在自由基会抑制某种蛋白产生荧光，抗氧化剂的出现两种方法均利用在自由基会抑制某种蛋白产生荧光，抗氧化剂的出现会抑制这种抑制作用的产生，利用荧光强度反应抗氧化活性会抑制这种抑制作用的产生，利用荧光强度反应抗氧化活性v TRAP是一种常用的检测血浆和血清体系的总抗氧化能力的方法，检查的是非酶类的抗氧化物质 缺点：反应滞后时间与抗氧化能力不总是成正比例v ORAC法该法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，主要检测抗氧化物质对由AAPH产生的过氧化自由基的清除效果。该过程发生在37下，借助氢原子的转移来实现。 缺点：仪器设备较复杂，检测成本较高二氯荧光素二乙酸
7、酯二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法法v DCFH-DA(二氧荧光素二乙酸酯)法也是测定总的自由基清除能力。AAPH产生的过氧自由基氧化DCFH-DA生成DCF(dichlorofluorescein，二氯荧光黄) 。DCF有很强的荧光，在504 nm有吸收，因此可用荧光法或分光光度法检测。总氧自由基清楚能力（总氧自由基清楚能力（TOSC）v TOSC(自由基清除能力)法是一种相当新的测量体外抗氧化活性的方法。此法是根据过氧自由基、过氧化氮或OH将KMBA氧化生成乙烯，生成的乙烯可用顶空气相色谱检测。在有抗氧化剂存在时，抗氧化剂与KMBA对过氧自由基竞争反应，乙烯的形成被部分地抑制。藏花素
8、漂白法藏花素漂白法(crocin bleaching test) v 藏花素漂白法(crocin bleaching test)用于测定复杂混合物和食品的抗氧化能力。藏花素是一种天色化合物(类胡萝卜素的一种),在可见光区(443nm有强吸收。在有过氧自由基(可由AAPH或ABAP热分解生成)时,藏花素颜色变浅(被漂白);添加抗氧化剂后,藏花素的漂白速率减慢v 缺点：藏花素本身也是一种抗氧化剂DPPH法v DPPH法是1950年代提出的，最初用于发现食物中的供氢体，后来广泛用于定量测定生物试样、酚类物质和食品的抗氧化能力。DPPH(2， 2-diphenyl1picrylhydrazyl， 2，
9、2-二苯代苦味酰基苯肼)是一种稳定的自由基，其乙醇溶液显紫色，在515 nm处有最大吸收。当有供氢能力的抗氧化剂存在时(如酚类)，DPPH溶液的颜色变浅，吸光度值变小。根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。v 缺点：自由基为人工产生，非人体内所有。自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应ABTS法v ABTS法中ABTS可被各种试剂氧化生成蓝绿色的自由基阳离子ABTS+，ABTS+相当稳定。在有供氢能力的抗氧化剂(如酚类物质)存在下，ABTS+与之反应，变成没有颜色的ABTS。v 用于测定组织样品中血红蛋白的含量。改进后用于测定生物样品的抗氧化活性，广泛应用于食品和天然水溶
10、性酚类物质抗氧化活性的测定测定还原能力方法测定还原能力方法v基本原理：基本原理：该类方法测定的是抗氧化剂的还原能力，主要方法有铁离子还原测定、该类方法测定的是抗氧化剂的还原能力，主要方法有铁离子还原测定、铜离子还原测定、总酚测定和循环伏安法，此外还有其它一些金属离子铜离子还原测定、总酚测定和循环伏安法，此外还有其它一些金属离子的还原测定，如锰离子等的还原测定，如锰离子等常用的铁、铜离子还原法，总酚测定法常用的铁、铜离子还原法，总酚测定法铁离子还原能力铁离子还原能力(FRAP)法法v 经常使用的是基于氧化还原反应的比色法v 当体系里PH值小于7时，体系当中的Fe3+一TPTA(Fe3+一三吡啶三
11、嗪)被抗氧化剂还原成Fe2+一TPTz，体系的颜色会成为深紫色，产物在593nm处有强吸收峰。v 优点：简单，易操作，可以重复。该方法主要用在食品业，抗氧化剂开发领域。v 缺点：能还原三价铁的并非只是抗氧化剂，同时有些促抗氧化剂在试验中可能会无法体现，同时无法测定硫醇化合物的还原能力。 在在SCI文章中出现频率最高的文章中出现频率最高的10种方法：种方法： DPPH、羟自由基、超氧自由基、ABTS、FRAP、ORAC、总酚估计法、TBARS法、硫酸氰铁法、鳌合金属离子 国际化学学会在奥兰多第二届国际抗氧化方法会议上公认ORAC是最好的方法，推荐使用ORAC、总酚估计法方法方法选择选择建建议议原原则则测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要求:v (1)能说明测试体系中发生的反应，并能用明确的动力学图解描述v (2)测试要有再现性v (3)测试效率要足够高v (4)方法要相对简单v (5)能连续检测v (6)应使用与体内或食品有关的活性自由基v (7)分析中被测物的浓度在食品中或在生物体内能够得到v (8)除了适合纯溶液外，还适合复杂生物组织和天然产物的测定v (9)水溶性的和脂溶性的化合物都适用Company LogoCompany LogoThank you