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1、实验实验 十五十五 脂质体的制备脂质体的制备 1. 1.了解脂质体（了解脂质体（liposomeliposome）在细胞）在细胞工程技术中的应用及其制备方法。工程技术中的应用及其制备方法。 2.2.掌握采用超声波法、冰冻干燥法掌握采用超声波法、冰冻干燥法和冻融法三种不同的方法制备脂和冻融法三种不同的方法制备脂质体的方法并了解该技术在细胞质体的方法并了解该技术在细胞工程中的应用。工程中的应用。一一 实验目的实验目的 脂质体（脂质体（liposomeliposome）的制备技）的制备技术，一般采用超声波法、振荡法、术，一般采用超声波法、振荡法、乙醚蒸发法、去污剂透析法、冰乙醚蒸发法、去污剂透析法、
2、冰冻干燥法和冻融法等。制备方法冻干燥法和冻融法等。制备方法不同，所得脂质体结构、大小不不同，所得脂质体结构、大小不同，性质和用途也就不同（表同，性质和用途也就不同（表15-15-1 1）。）。二二 实验原理实验原理种类种类制备方法制备方法 大小大小(m)特性特性多层大脂质体多层大脂质体(MLV)乙醚蒸发法、醇醚水乙醚蒸发法、醇醚水法法、振荡法振荡法、液相快液相快速混合振荡法速混合振荡法 0.150易制备，包被物释放易制备，包被物释放速度慢速度慢单层小脂质体单层小脂质体(SUV)直接超声波法直接超声波法、溶剂溶剂超声波法超声波法、乙醚注射乙醚注射法法 0.020.05体积小，适合包被离体积小，适
3、合包被离子、小分子药物等子、小分子药物等单层大脂质体单层大脂质体(LUV)递相蒸发法递相蒸发法、去污剂去污剂（胆酸纳等）透析法（胆酸纳等）透析法、冰冻干燥法冰冻干燥法 0.050.5 适合包被蛋白质、适合包被蛋白质、RNA、DNA片段、片段、大分子药物及细胞融大分子药物及细胞融合合 单层巨大脂质体单层巨大脂质体(GUV)冻融法冻融法 530适合包被蛋白质、适合包被蛋白质、RNA、DNA片段，片段，除菌处理较难除菌处理较难 本实验采用超声波法、冻融法、冰冻干燥本实验采用超声波法、冻融法、冰冻干燥法三种不同类型的方法，超声波法的原理是：法三种不同类型的方法，超声波法的原理是：在超声波作用下，磷脂类
4、双亲媒性分子被打碎在超声波作用下，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分子或分子团，并自动重新排布成类似生物为分子或分子团，并自动重新排布成类似生物膜的双分子层囊泡。冻融法是在超声波法形成膜的双分子层囊泡。冻融法是在超声波法形成的小脂质体基础上，通过冷冻和融解过程使其的小脂质体基础上，通过冷冻和融解过程使其破裂，重组为大体积脂质体，在通过透析时膜破裂，重组为大体积脂质体，在通过透析时膜内外渗透压的变化而膨胀为更大体积的脂质体。内外渗透压的变化而膨胀为更大体积的脂质体。冰冻干燥法语原理与冻融法基本一致，只在处冰冻干燥法语原理与冻融法基本一致，只在处理条件上有所不同。理条件上有所不同。1.器材器材 超声波清
5、洗机、光学显微镜、荧光显微镜、荧光超声波清洗机、光学显微镜、荧光显微镜、荧光分光光度计、漩涡混合器、核酸蛋白检测仪、柱分光光度计、漩涡混合器、核酸蛋白检测仪、柱层析装置、冰冻干燥机。层析装置、冰冻干燥机。 2.试剂试剂 ）磷脂液：）磷脂液：100mg经丙酮经丙酮-乙醚法纯化的卵磷乙醚法纯化的卵磷脂，脂，57.2mg胆固醇，溶于胆固醇，溶于1ml氯仿。氯仿。 ）荧光液：钙黄绿素（）荧光液：钙黄绿素（calcein）47mg溶于溶于100ml Tris缓冲液。缓冲液。 ）Tris 缓冲液：称取缓冲液：称取Tris 0.12g，EDTA 0.288mg，溶于，溶于80ml去离子水中，用去离子水中，用
6、0.1 mol/L盐酸调盐酸调Ph7.2，再加水至，再加水至100ml。三三 实验用品实验用品 4)2% 4)2%叠氮钠液。叠氮钠液。 5)5)透析液：称取透析液：称取EDTAEDTA2.88mg2.88mg，加入，加入143ml143ml荧光液中，再加无离子水至荧光液中，再加无离子水至1000ml1000ml，同时加入同时加入10ml10ml叠氮钠液。叠氮钠液。 6)10m 6)10m mol/Lmol/L氯化钴液。氯化钴液。 1. 1.超声波法制备脂质体超声波法制备脂质体取磷脂液取磷脂液330l330l于于2.0ml2.0ml安瓿瓶中安瓿瓶中，真真空干燥空干燥20min20min，再加入荧
7、光液再加入荧光液530l530l及液及液530l530l，充氮气，充氮气、封口封口、漩涡混合器混漩涡混合器混匀匀，与超声波清洗机中处理处理与超声波清洗机中处理处理10min10min（电流电流200300mA200300mA），所得液体即为单层所得液体即为单层小体积脂质体小体积脂质体（SUVSUV）。）。四四 实验步骤实验步骤直径分配率计算：取直径分配率计算：取16l16l适当稀释的脂质适当稀释的脂质体液（一般稀释体液（一般稀释100100倍）加在载玻片上，盖上盖玻倍）加在载玻片上，盖上盖玻片，并用凡士林封口，用目微尺观测片，并用凡士林封口，用目微尺观测5 5个视野里的个视野里的脂质体直径，记
8、录，按下式计算直径分配率脂质体直径，记录，按下式计算直径分配率D D。D=XD=X1 1(00.01)+X(00.01)+X2 2(0.010.02)(0.010.02)2+X2+X3 3(0.020.03)(0.020.03)3+3+/N/N其中其中X1X1为为5 5个视野里个视野里00.01m00.01m直径脂质体数的直径脂质体数的平均值，平均值，N N为视野数为视野数5 5。包被率计算包被率计算：取取15l15l脂质体液稀释液于脂质体液稀释液于2985l2985lTrisTris液中液中，在荧光分光光度计上测量在荧光分光光度计上测量荧光强度荧光强度(A)(A)；加入加入12l12lCoC
9、lCoCl2 2液，静置液，静置5min5min，使脂质体外的荧光猝灭，测量膜内荧光强度使脂质体外的荧光猝灭，测量膜内荧光强度值值（B B）；）；加入加入150l150l 10%Triton X-100 10%Triton X-100破膜破膜液，破膜液，破膜5min5min，再测量荧光强度，再测量荧光强度(C)(C)。包被率包被率=(B-C)/(A-C)=(B-C)/(A-C) 其中其中A A为总荧光强度，为总荧光强度，B B为脂质体荧光强为脂质体荧光强度，度，C C为本底荧光强度。为本底荧光强度。 2.2.冻融法制备脂质体冻融法制备脂质体 取磷脂液取磷脂液330l330l于安瓿瓶中，真空干燥
10、于安瓿瓶中，真空干燥20min20min，加入加入TrisTris液液530l530l，充氮气，封口，漩涡均匀，充氮气，封口，漩涡均匀，超声波处理超声波处理5min5min（电流（电流200300mA200300mA），打开瓶口，），打开瓶口，加入荧光液加入荧光液140l140l，氯化钾，氯化钾112mg112mg，漩涡均匀，漩涡均匀，然后置于干冰然后置于干冰- -丙酮浴中冷冻丙酮浴中冷冻1min1min。取出，室温。取出，室温融解，漩涡均匀。冻融过程重复两次。完成后融解，漩涡均匀。冻融过程重复两次。完成后将脂质体装入透析袋中，在磁力搅拌下对透析将脂质体装入透析袋中，在磁力搅拌下对透析液透析液
11、透析2h2h，换透析液两次（用于与原生质体融，换透析液两次（用于与原生质体融合实验时，透析时间与透析配方可与原生质体合实验时，透析时间与透析配方可与原生质体培养基适当配合），即得单层巨大脂质体培养基适当配合），即得单层巨大脂质体（GUVGUV）。）。 直径分配率计算及包被率测定同超声波法。直径分配率计算及包被率测定同超声波法。记录测定结果。记录测定结果。 3.3.冰冻干燥法制备脂质体冰冻干燥法制备脂质体 取磷脂液取磷脂液330l330l于安瓿瓶中于安瓿瓶中，真空干燥真空干燥20min20min，加入加入TrisTris液液530l530l，充氮气充氮气，封口封口，涡涡旋均匀旋均匀，超声波处理超
12、声波处理（电流（电流200300mA200300mA）5min5min，打开瓶口，加入荧光液打开瓶口，加入荧光液140l140l，涡旋均匀。涡旋均匀。冰冻干燥冰冻干燥10h10h，取出后加无离子水取出后加无离子水1ml1ml，涡旋涡旋均匀，室温静置均匀，室温静置1h1h，超声波处理，超声波处理1min1min，即得即得单层大脂质体单层大脂质体(LUV)(LUV)。如需更大体积脂质体如需更大体积脂质体可重复冻干过程两次。可重复冻干过程两次。 直径分配率及包被率测定同超声波法，直径分配率及包被率测定同超声波法，记录测定结果。记录测定结果。 4.4.均一脂质体的制备均一脂质体的制备 冻融法和冰冻干燥
13、法所制备的脂质体皆可作为冻融法和冰冻干燥法所制备的脂质体皆可作为DNADNA、蛋白质或其他较大分子的载体，用于药物、蛋白质或其他较大分子的载体，用于药物运载及与原生质体的融合等。一般来说，作为载运载及与原生质体的融合等。一般来说，作为载体的脂质体在实用前都须经均一化处理。体的脂质体在实用前都须经均一化处理。 将琼脂糖凝胶将琼脂糖凝胶4B4B柱柱（1 120cm20cm）用用TrisTris液品平衡液品平衡3 3倍柱体积（约倍柱体积（约47ml47ml），流速），流速0.5ml/min0.5ml/min，平衡完，平衡完全后，取脂质体液全后，取脂质体液0.5ml0.5ml常规上样常规上样，Tris
14、Tris液洗脱，液洗脱，洗脱速度洗脱速度0.3ml/min0.3ml/min，用核算蛋白检测仪检测洗脱用核算蛋白检测仪检测洗脱液液A280A280，收集第一峰，收集第一峰，即为较均一的脂质体。即为较均一的脂质体。 以以A280A280为纵坐标，洗脱液体积为横坐标，画为纵坐标，洗脱液体积为横坐标，画出脂质体洗脱曲线。出脂质体洗脱曲线。 1. 1.脂质体的结构及用途如何？脂质体的结构及用途如何？ 2.2.简述制备脂质体的基本步骤。简述制备脂质体的基本步骤。 3.3.比较超声波法、冰冻干燥法所制备的脂质比较超声波法、冰冻干燥法所制备的脂质体的体积，并解释其原因。体的体积，并解释其原因。 五五 思考题思考题