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1、我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物ESTEST是从一个随机选择的是从一个随机选择的cDNA cDNA 克隆进行克隆进行55端和端和33端端单一次测序获得的短的单一次测序获得的短的cDNA cDNA 部分序列部分序列, ,代表一个完整代表一个完整基因的一小部分基因的一小部分, ,在数据库中其长度一般从在数据库中其长度一般从20 20 到到7000bp 7000bp 不等不等, ,平均长度为平均长度为360 360 120bp 120bp 。EST EST 来源于来源于一定环境下一个组织总一定环境
2、下一个组织总mRNA mRNA 所构建的所构建的cDNA cDNA 文库文库, ,因此因此ESTEST也能说明该组织中各基因的表达水平。也能说明该组织中各基因的表达水平。首先从样品组织中提取首先从样品组织中提取mRNA ,mRNA ,在逆转录酶的作用下用在逆转录酶的作用下用oligo ( dT) oligo ( dT) 作为引物进行作为引物进行RT -PCR RT -PCR 合成合成cDNA ,cDNA ,再选择再选择合适的载体构建合适的载体构建cDNA cDNA 文库文库, ,对各菌株加以整理对各菌株加以整理, ,将每一将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两个菌株的插入片段根
3、据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序端一次性自动化测序, ,这就是这就是EST EST 序列的产生过程。序列的产生过程。Copyright restrictions may apply.Kim, J.-M. et al. DNA Res 2006 13:275-286; doi:10.1093/dnares/dsl016Quantitative real-time RT-PCR of upregulated or downregulated genes randomly selected from the libraries of human normal SN (黑质黑质)and
4、 PDs SNCopyright restrictions may apply.Kim, J.-M. et al. DNA Res 2006 13:275-286; doi:10.1093/dnares/dsl016Immunohistochemical staining for TH and alpha-tubulin in the SN of an MPTP mice modelTHalpha-tubulinCopyright restrictions may apply.Cell death activity of differentially expressed genes in PD
5、Upregulated genesDownregulated genesAmino Acid Sequences of Orexins (食欲素食欲素) and Orexin Receptors(A) Structures of mature orexin-A and -B peptides Cell 1998; 92(4): 573-585 Tissue Distribution of Rat prepro-orexin and Orexin Receptor mRNAsA Cell 1998; 92(4): 573-585 Localization of prepro-orexin mRN
6、A and Immunoreactive Peptide in Adult Rat Brain Cell 1998; 92(4): 573-585Up-Regulation of prepro-orexin mRNA in Fasted Rats Cell 1998; 92(4): 573-585我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因芯片（基因芯片（Gene ChipGene Chip）通常指）通常指DNADNA芯片，其基本原理芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标是将
7、指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）、微阵列（）、微阵列（MicroarrayMicroarray）、）、DNADNA芯片（芯片（DNA chipDNA chip），甚至蛋白芯片。），甚至蛋白芯片。 INH(异烟阱异烟阱)-induced mRNA expression profiles monitored by microarray hybridizati
8、on analysis. 用用INHINH处理处理INH INH 敏感敏感的结核菌株的结核菌株( (红红:INH:INH处处理的理的; ;绿绿:INH:INH未处理的未处理的) )PNAS 1999; 96(22):12833-12838. 用用INH处理处理INH 耐药的结核菌株耐药的结核菌株用乙硫异烟胺处理用乙硫异烟胺处理INH 耐药的结核菌株耐药的结核菌株Temporal profile of INH-induced expression of selected genes. PNAS 1999; 96(22): 12833-12838.Roles of INH-induced gene
9、s in the context of a proposed pathway for mycolic acid (结核环脂酸结核环脂酸)biosynthesis. PNAS 1999; 96(22):12833-12838. The ChIP-DSL scheme PNAS 2007; 104（2): 4852-4857 E2-induced gene expression and the biological relevance of direct ER target genesPNAS 2007; 104（2): 4852-4857 E2-induced gene expression a
10、nd the biological relevance of direct ER target genesPNAS 2007; 104（2): 4852-4857 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物An inhibitory glycine synapse Trends Pharmacol Sci. 2005;26(6):283-286 GLYT: GLYT: 甘氨酸酸转运子甘氨酸酸转运子A glutamate synapse. Trends Pharmacol Sci. 2005;26(6)
11、:283-286 GMS:GMS:修饰后的修饰后的NMDANMDA受体受体Flowchart of the Knockout Strategy Curr Biol. 2005;15(18):1663-1669 http:/mendel.imp.ac.at/Pombe_deletionmde2 Is Required for Segregation of Homologous Centromeres during Meiosis I Curr Biol. 2005;15(18):1663-1669 Deletion of mde2 Permits a Strain Expressing a Re
12、c8 Protein Refractory to Separase Cleavage to Undergo the First Meiotic Division without Precocious Separation of Sister Chromatids Curr Biol. 2005;15(18):1663-1669 Curr Biol. 2005;15(18):1663-1669 Double-Strand-Break Formation Is Strongly Reduced in mde2 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感
13、到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连转导入细胞把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连转导入细胞内内, ,通过简单地检测酶活性的变化通过简单地检测酶活性的变化, ,就可以反映化合物对转录因子和就可以反映化合物对转录因子和基因表达的作用性质和程度。这种能间接反映基因转录水平的编码基因表达的作用性质和程度。这种能间接反映基因转录水平的编码某种酶活性的基因称为报告基因。某种酶活性的基因称为报告基因。 Structure of SB 247464 Science. 1998;281(5374):257-259 Activity of
14、G-CSF(粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子) and SB 247464 in NFS60 cell luciferase assays Science. 1998;281(5374):257-259 Phosphorylation of signaling proteins in cells treated with SB 247464 or G-CSF. Science. 1998;281(5374):257-259 The murine G-CSF receptor confers responsiveness to SB 247464. Science. 1998;281(537
15、4):257-259未转染受体未转染受体转染转染CSF受体受体Granulocytic colony formation in response to SB 247464 in vitro. Granulopoietic activity of SB 247464 in vivo. Science. 1998;281(5374):257-259我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 Drug entry route into C. elegans(Drug entry route into C.
16、elegans(秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫) )Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398 The serotonergic synapse of C. elegans.Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398 Overview of the RNA interference supported target identification processNat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398 Chemical genetics as a tool for target site identificat
17、ionNat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398 Chemical genetics as a tool for target site identificationNat Rev Drug Discov 2006; 5: 387-398Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 ;103(27):10414-10419Curing of a nematode E. faecalis infection on solid medium by antibiotic treatment Tet:四环素四环素Cipro:万古霉素万古霉素Van:环丙沙星
18、环丙沙星Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 ;103(27):10414-10419The liquid infection assay gauges differences in nematode killing due to E. faecalis strains with varying degrees of pathogenicity or due to antibiotic treatment. Cyl:溶细胞素溶细胞素Amp:氨苄青霉素氨苄青霉素Scoring live/dead worms in the liquid killing assay Proc
19、 Natl Acad Sci U S A. 2006 ;103(27):10414-10419 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物核酶核酶: :用于描述具有催化活性的用于描述具有催化活性的RNA,RNA,即化学本即化学本 质是核糖核酸质是核糖核酸(RNA)(RNA)， 却具有酶的催化功能。却具有酶的催化功能。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它
20、放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜
21、测没有错：表里边有一个活的生物鸡的卵清蛋白基因初始鸡的卵清蛋白基因初始RNARNA转录物的剪接转录物的剪接 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Ribozyme design and gene activation Nucleic Acids Res.2002;30(24):e141 Ribozyme-mediated phenotype alteration on indicator media. Nucleic Acids Res. 2002;30(24):e141 Test for tar
22、get-independent growth on selective media.Nucleic Acids Res. 2002;30(24):e141Relative growth rate of strains expressing ribozymes with DTA sequences as the 3 exon Nucleic Acids Res. 2002;30(24):e141 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽
23、的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Table 1. PS-ODNs targeting the M. tuberculosis 30, 32A, and 32B protein (分枝酰基转移酶分枝酰基转移酶)gene transcripts PS-ODNs: antisense phosphorothioate oligodeoxyribonucleotides ; MM: 错配的核苷酸错配的核苷酸HPS-ODNs: 5-
24、, 3-hairpin-modified PS-ODNs 发夹修饰的反义寡核苷酸发夹修饰的反义寡核苷酸Inhibition of M. tuberculosis growth by antisense HPS-ODNs specific for the 30/32-kDa protein gene complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(17):7199-7204Specific inhibition of protein synthesis by antisense HPS-ODNs. Proc Natl Acad Sci U S A. 200
25、7;104(17):7199-7204Inhibition of 30, 32A, and 32B protein gene transcript synthesis Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(17):7199-7204HPS-ODN inhibition of M. tuberculosis multiplication in human macrophages Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(17):7199-7204 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到
26、愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物转录后基因表达抑制现象的发现转录后基因表达抑制现象的发现CHS GeneCHS Gene矮牵牛花矮牵牛花(Jorgensen, R, 1990)(Jorgensen, R, 1990)CHS: CHS: 与色素合成相关的与色素合成相关的酶酶, , 以加深花的颜色以加深花的颜色我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物RNAi 现象的发现现象的发现线虫（线虫（C. elegans)C. elegans)(Andrew (Andrew Fire, 1998Fi
27、re, 1998) )+Par-1 Gene Par-1 Gene DisruptionDisruptionExpressionExpressionDownDownDouble Strand RNADouble Strand RNA线线 虫，虫， 果果 蝇蝇微生物，微生物， 植植 物物 失败的原因失败的原因: :在合成反义在合成反义RNARNA时存在技术问题时存在技术问题, ,用于注射的正用于注射的正义和反义义和反义RNARNA中都混有少量双链中都混有少量双链RNARNAdsRNAdsRNADicer cleavage of dsRNADicer cleavage of dsRNAsiRNAs
28、iRNARNAi RNAi 抑制基因表达的机理抑制基因表达的机理siRNA associatedsiRNA associatedWith RISC complexWith RISC complexCell MembraneCell Membrane5POH3Target mRNATarget mRNADicer: Dicer: 是一种核酸是一种核酸酶酶, ,将双链将双链RNARNA降解成降解成21-23bp21-23bp的小干扰的小干扰RNARNARISC: RNARISC: RNA诱导的诱导的沉默小体沉默小体, ,他是由他是由单链单链siRNAsiRNA与一些与一些蛋白形成的复合体蛋白形成的
29、复合体我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物RNARNA干扰干扰(RNA interference, RNAi)(RNA interference, RNAi) RNAi RNAi 是将一段双链的是将一段双链的RNA RNA 序列导入机体或细胞中序列导入机体或细胞中, ,机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到抑制机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到抑制, ,甚至表达受到完全抑制甚至表达受到完全抑制Decreased human MK expression in PC-3 cell
30、s transfected with various siRNAsCancer. 2006;107(4):864-873 MK: MK: 肝素结合细胞因子肝素结合细胞因子Effect of treatment with MK siRNA combined with PTX (紫杉醇) on PC-3 cell viability and anchorage- independent growthCancer. 2006;107(4):864-873 PTX:siRNA-SCR:siRNA-SCR:乱序乱序siRNSsiRNSDetermination of a suitable dose an
31、d the duration of the siRNA to downregulate MK in PC-3 xenograftsCancer. 2006;107(4):864-873 Antitumor effect of MK siRNA in PC-3 xenografts.Cancer. 2006;107(4):864-873 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一
32、个活的生物抗体除对组织和细胞中特异性抗原进行定位外，尚有强大的中和能力阻断蛋白质功能。对于细胞内的靶分子，需要以合适的方式将抗体导入细胞。显微注射是一种将抗体注入细胞的方式，但是这种方式难以做到高通量，影响了药物靶标发现验证的速度。为了满足高通量研究的需要，Moris 创建了一套化学试剂方法将抗体导入细胞，而抗体的功能和细胞的活性不受影响。另一种将抗体导入细胞的方式是让抗体在细胞内表达(intrabodies)，其中包括使用灭活病毒的方法。 A bispecific, tetravalent intradiabody J Biol Chem. 2003;278(48):47812-47819I
33、ntrabody and Tie-2/VEGF-R2 colocalization on HUVEC J Biol Chem. 2003;278(48):47812-47819A, kinetics of surface expression of Tie-2 and VEGF-R2 after gene transfer of the intradiabody and conventional scFv intrabodies on HUVEC using recombinant adenoviruses with an MOI of 10 B, gene transfer of intra
34、bodies directed to human Tie-2, VEGF-R2, or Tie-2/VEGF-R2 by recombinant adenoviruses on day 6 after infection J Biol Chem. 2003;278(48):47812-47819Inhibition of capillary tube formation in vitro J Biol Chem. 2003;278(48):47812-47819 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的
35、生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物CALlCALl能够直接对蛋白质进行操作，而不是能够直接对蛋白质进行操作，而不是通过对蛋白质量的变化进行检测。将标记通过对蛋白质量的变化进行检测。将标记有孔雀绿染料的非功能灭活抗体与特异性有孔雀绿染料的非功能灭活抗体与特异性蛋白质结合，然后对蛋白质复合物进行激蛋白质结合，然后对蛋白质复合物进行激光照射。染料受激光激发短暂的产生活性光照射。染料受激光激发短暂的产生活性分子，对结合的蛋白质造成破坏而起到灭分子，对结合的蛋白质造成破坏而起到灭活作用，但不影响其他
36、蛋白质组分。活作用，但不影响其他蛋白质组分。A lentiviral system for simultaneous knockdown and rescue with a functional EGFP-fusion complement. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(16):6702-6707CALI of EGFP-CP induces the formation of dorsal ruffles and filopodia only in the knockdown/rescue background. Proc Natl Acad Sci
37、U S A. 2007;104(16):6702-6707CALI of EGFP-CP in KDR cells generates a local increase in barbed ends of actin filaments and dorsal F-actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(16):6702-6707CALI of EGFP-Mena in Mena/VASP-deficient cells induces more stable lamellipodial protrusions Proc Natl Acad Sci U
38、 S A. 2007;104(16):6702-6707 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 基因是一段基因是一段DNADNA（脱氧核糖核酸分子脱氧核糖核酸分子）双链。）双链。 碱基成对出现碱基成对出现: -ATCGGCC-: -ATCGGCC- -TAGCCGG- -TAGCCGG- 中心中心法则（法则（The The C Central entral D Dogmaogma） 一级结构一级结构 - - 氨基酸序列氨基酸序列二级结构二级结构 - - 主要由氢键稳固的局部构象，主要由氢键稳固的
39、局部构象， 如如 -helix, -helix, -sheet-sheet等等三级结构三级结构 - - 三维构象三维构象四级结构四级结构 - - 多个多肽链的组合多个多肽链的组合分子表面分子表面 - 分子可视化分子可视化 - 分子对接分子对接 - 基于结构的药物设计基于结构的药物设计 - 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物生物学问题生物学问题的提出的提出实验模
40、型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物
41、蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物蛋白质二维电泳：蛋白质二维电泳：蛋白质提取蛋白质提取样品前处理样品前处理一向等一向等电聚焦电聚
42、焦二向二向SDSPAGE凝胶银染及扫描凝胶银染及扫描双向电泳分双向电泳分析软件分析析软件分析差异蛋白差异蛋白质点的质质点的质普分析普分析生物信息数据查询、建立蛋白质数据库生物信息数据查询、建立蛋白质数据库我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物可溶性样品可溶性样品 固体组织样品固体组织样品 细胞细胞不同样品的基本处理方法不同样品的基本处理方法样品的分级处理样品的分级
43、处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎
44、子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物垂直板凝胶垂直板凝胶电泳装置电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向电
45、泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳缓冲液缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和
46、恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽链分子量链分子量。 相对迁移率相对迁移率水平式电泳装置水平式电泳装置电泳缓冲液电泳缓冲液凝胶凝胶B. 等电聚焦等电聚焦电泳（电泳（ IFE） 利用聚丙烯酰利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电在电场作用下沿电场方向在凝胶内制场
47、方向在凝胶内制造一个造一个pH梯度。梯度。 每种蛋白质都每种蛋白质都将迁移至与它的将迁移至与它的pI 相一致的相一致的pH处。处。凝胶中加凝胶中加有两性电有两性电解质溶液解质溶液（pH9-3） 加电场后加电场后在凝胶内形在凝胶内形成一个稳定成一个稳定pH梯度梯度 加样品，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明凝胶染色表明样品按照各自样品按照各自pI值沿着值沿着pH梯度分布梯度分布等等电电聚聚焦焦电电泳泳进进行行过过程程中中等等电电聚聚焦焦电电泳泳结结束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）高高pH高高pH低低pH低低pH：等电聚焦电泳：等电聚焦电泳：SDS-PAGE 双向电泳后的凝胶双向
48、电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维经染色后蛋白呈现二维分布图：分布图： 水平方向反映出蛋白水平方向反映出蛋白在在pI上的差异，上的差异，垂直方向反映出它们在垂直方向反映出它们在分子量上的差别分子量上的差别。第一向电第一向电泳：等电泳：等电聚焦电泳聚焦电泳聚焦后凝聚焦后凝胶放置在胶放置在SDS凝胶凝胶上，进行上，进行第二向电第二向电泳泳第二向电泳：第二向电泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也
49、感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程 样品制备样品制备 与与IPG胶条水化胶条水化 IPG电泳电泳 与上样缓冲液浸润与上样缓冲液浸润 SDS-PAGE 转转PVDF膜膜 胶内直接染色胶内直接染色 染色染色 取出蛋白点取出蛋白点 胰酶等消化胰酶等消化 浓缩于多孔吸附柱上浓缩于多孔吸附柱上 MALDI-MS肽指纹图肽指纹图 数据库查询数据库查询 蛋白质鉴定蛋白质鉴定 已知已知 反向反向HPLC分离分离 MALDI-MS，PSD片段分析片段分析示知示知 ESI-MS-MS、微测序、微测序 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的
50、东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物实验方法实验方法完整蛋白质（如凝胶分离或完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）色谱纯化蛋白质）肽混合物肽混合物质谱测定肽质量质谱测定肽质量（MALDI-MS,ESI-MS)选择肽段裂解选择肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)计算方法计算方法蛋白质序列数据库（核酸序列翻译数据库）蛋白质序列数据库（核酸序列翻译数据库）肽质量检索：肽质量检索：片片1.ppt 未解析碎片离子检索：未解析碎片离子检索：片片2.ppt酶切酶切我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一