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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 细心整理 学习资料细胞冻存和细胞复苏细胞冻存及复苏的基本原就是慢冻快融,试验证明这样可以最大限度的保存细胞活力；目前细胞冻存多采纳甘油或二甲基亚砜作爱护剂,这两种物试验 方法 原理质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,削减细胞内冰晶的形成,从而削减由于冰晶形成造成的细胞损耗；复苏细胞应采纳快速融解的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融解,防止由于缓慢融解使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损耗；试验材料 细胞试剂、试剂 D-Hanks 液 小牛血清 培育液 青霉素 链霉素 胰蛋白酶 HCl NaHCO
2、3盒 DMSO 甘油微量加样枪 吸头 离心管 冻存管 枪头 胶塞 移液管玻璃瓶 红血球计数仪器、板 记号笔 医用橡皮膏 移液枪 超净工作台 离心机 恒温水浴箱 冰箱耗材倒置相差显微镜 培育箱 液氮冰箱一、材料预备1. 仪器：净化工作台、 离心机、恒温水浴箱、 冰箱（4、-20、-70）、倒置相差显微镜、培育箱、液氮冰箱；2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、 培育瓶、玻璃瓶（ 250ml 、100ml ）、废液缸；3. 塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、移液管（存管（ 12ml）；10ml ）、15ml 离心管、冻试验 步骤4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液 枪；5.
3、 试剂： D-Hanks 液、小牛血清、培育液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（ 0.08% ）、1NHCl 、7.4%NaHCO3 、DMSO （分析纯）或无色 新奇甘油；二、细胞冻存1. 配制含 10%DMSO 或甘油、 1020% 小牛血清的冻存培育液；名师归纳总结 2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮第 1 页,共 4 页生长的细胞就直接将细胞移至15ml 离心管中；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 细心整理 学习资料3. 离心 1 000 rpm ,5 min ；4. 去除胰蛋白酶及旧的培育液,加入适量配制好的
4、冻存培育液,用吸管 轻轻吹打使细胞匀称, 计数,调剂冻存液中细胞的最终密度为 5 106/ml1107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中,每管 11.5 ml ；6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min；当温度达 -25以下 时,可增至 -5-10/min ；到-100 时,就可快速浸入液氮中；也可将装有细胞的冻存管放入 -20冰箱 2 h ,然后放入 -70冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内；三、 细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入 快融解；37温水中,并不时摇动令其尽2. 从 37水浴中取出冻存管,打开盖子,用
5、吸管吸出细胞悬液,加到离 心管并滴加 10 倍以上培育液,混匀；3. 离心, 1 000 rpm ,5 min ；4. 弃去上清液,加入含 10% 小牛血清培育液重悬细胞,计数,调整细胞 密度,接种培育瓶, 37培育箱静置培育；5. 次日更换一次培育液,连续培育；收起1. 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培育细胞都可以用于冻存,但 最好为对数生长期细胞；在冻存前一天最好换一次培育液；留意 事项2. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤；3. 冻存和复苏最好用新配制的培育液；名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - -
6、 - - - 细心整理 学习资料一、冻存和复苏的原就：慢冻快融 当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化：细胞器脱水,细胞中可溶性物 质浓度上升,并在细胞内形成冰晶；假如缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶；相反,结 晶就大,大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损耗和破裂；复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶；二、慢冻程序 1. 标准程序：采纳细胞冻存器 当温度在 -25 以上时, 12 /min；当温度达 -25 以下时,510 /min；当温度达 -100 时,可快速放入液氮中；2. 简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内,纱布袋系以线绳,12 的速度,通过线
7、绳将纱布袋固定于液氮罐罐口,按每分钟温度下降 在 40 min 内降至液氮表面过夜,次晨投人液氮中；其他3. 传统程序：冷冻管置于 4 10 分钟 -20 30 分钟 -80 1618 小时（或隔夜） 液氮槽长期储存；三、低温爱护剂的应用 在细胞冻存时加入温爱护剂,能大大提高冻存成效；常用的低温爱护剂是DMSO ,它是一种渗透性爱护剂,可快速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻 结前透出细胞外,在胞形状成冰晶,削减胞内冰晶,从而削减冰晶对细胞 的损耗；四、细胞冻存方法1. 预先配制冻存液（1）10%DMSO + 细胞生长液（ 20%血清 +基础培育液）（2
8、）10% 甘油 + 细胞生长液（ 20% 血清 +基础培育液）名师归纳总结 2. 取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液,用吸管吹打制第 3 页,共 4 页成细胞悬液（ 1106 5 106细胞/ml）；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 细心整理 学习资料3. 加入 1 ml 细胞于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期；液 氮长期储存；五、储存细胞的复苏方法1. 快速解冻冻存细胞从液氮中取出后,立刻放入37水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在 1 分钟内全部融解（不要超过 3 分钟）；2. 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培育液的细胞培育瓶中直接进行培育, 24 小时后再用新奇完全培育液替换旧培育液,以去除 DMSO ；3. 假如细胞对冷冻爱护剂特殊敏锐解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻爱护剂,养液的培育瓶中；然后再接种到含完全生长培名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 4 页