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1、分子克隆及细胞培养基本实验方法1.载体构建实用操作技术1.1 菌种的保存20%甘油菌2 体积菌液与1 体积 70%的甘油混合后，储存于-20或 -70备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可）1.2 甘油菌复苏、培养方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp 的 LB 固体培养基上 （活化菌种） ，37培养过夜 （约 16 小时） ；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp的 LB 液体培养基中，37振荡过夜（约1216 小时）。方法二、直接吸取 1020ul 甘油菌，接种在含 100ug/ml Amp 的 LB 液体培养基中，37振荡过夜（约1216 小时）。1.3 小
2、规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ）适于从 15ml 菌液中制备20ug 高拷贝质粒收集菌液，离心1000rpm，分，弃上清以 250ul P1 重悬细菌（ P1 中已加 RNase）加入 250ul P2 ，颠倒 46 次轻混，约 23 分（轻混以免剪切基因组DNA ，并免长时间消化）加入 350ul N3 ，迅速颠倒46 次轻混；离心10 分， 13 000rpm 上清入 QIAprep 柱，离心 3060 秒，滤液弃之加入 0.5ml PB 洗，离心 3060 秒加入 0.75ml PE 洗，离心 3060 秒，弃滤液，再离心1 分换新管，加入50ul EB，静置 1
3、 分（ EB 37 预热），离心 1 分。1.4 酶切反应体系构成（反应体系尽可能小！）pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul ）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 16 页 - - - - - - - - - dd.H2O 17 17 10NEbuff 2 3 3 10BSA 3 3 底物 DNA 5 5 内切酶Hind1 1 Xba1 1 Total : 30 ul 30ul 37水浴 12 小时，必要时延长酶切时间至1
4、2 小时酶切 2 小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全65灭活内切酶-20保存备用1.5 回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol ） 胶，尽可能去除多余的胶，称重； 加入适量 buff QG （300ul QG /100mg 胶） ；2%的胶，应加大QG 用量（ 600ul QG /100mg） ； 水浴 50，10min，每 2-3min 混匀一次， 使胶完全溶解！ 必要时延长水浴时间，胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； 当 DNA 片段在 4kb 时，应加入异戊醇100ul/100mg 胶，以提高产物量。此步不离心。DN
5、A 片段在 500bp4kb 时，加入异戊醇并不能提高产量； 结合： 将混合物转入QIAquick 柱，离心 13000rpm，1min； （柱容量800ul/次） ； 洗：0.75ml buff PE ，离心 13000rpm，1min； （DNA 用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序，加入PE 后静置 2-5min） ；弃离心液，再离心13000rpm，1min，以去除剩余的乙醇； 将 QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep 管，加入3050ul buff EB 或 H2O （滴于 QIAquick 膜上！ ） ，静置 1min，离心 15000rpm，1min； -20保存备用
6、。1.6 连接反应名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 16 页 - - - - - - - - - 体系构成（反应体系20ul，载体：目的片段=1：3-5，摩尔数比）反应组份数量（ ul）dd.H2O 8 T4 10buff 2 载体（ul）1 目的片段（ ul）8 T4DNA 连接酶1 Total : 20 ul 16水浴 12-16 小时（过夜）直接用于转化或-20保存备用1.7 感受态细胞的制备 菌种 10-20ul 入 5ml LB 液体培养基（不加A
7、mp） ，37振摇 4-6 hr，至中对数期； 菌液冰浴 10min ，分装 2 管，离心（ 4， 4 000-6 000rpm ）收菌； 弃上清，将菌体悬浮于800ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴10min，离心（4，4000-6000rpm ） ； 再将菌体悬浮于200ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴，12-24hr 可用。菌体沉淀时，重悬操作要轻。1.8 转化 新鲜感受态细胞200ul，加入 2-10ul 连接产物， 轻轻旋转混合， 冰浴 30-60min ； 42热休克 90sec，勿摇动试管，再冰浴2min； 加入液体LB 培养基（无抗生素）800ul，37温
8、和振摇45-60min； 离心 4000-6000rpm ，2min ，弃去 900ul 上清； 剩余物重悬细菌，铺Amp 板，平放20min，倒置培养10-14hr 。1.9 鉴定重组子常规 PCR 法鉴定重组子（25ul 反应体系， 1ul 菌液）或抽提质粒DNA 酶切鉴定。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 16 页 - - - - - - - - - PCR 反应体系：试剂数量终浓度dd.H2O 17.5 ul 10PCR 缓冲液2.5 ul 1MgC
9、l2 （25mM ）1.5 1.5 mM dNTPmix(2.5mM) 1 ul 50uM 上游引物（25pmol/ul）0.5 ul 0.5uM 下游引物（ 25pmol/ul ）0.5 ul 0.5uM TaqDNA 聚合酶 (3U/ul) 0.5 ul 0.06U/ul 模板（菌液）1ul 终体积25ul PCR 反应参数：94，5min；“94， 30sec、50，30sec、72， 1min” 20-30 循环；72，6min；4，保存备用； 电泳鉴定，以挑选阳性重组子，注意阳性、阴性对照的设立。2.大规模制备质粒DNA（ QIAGEN Plasmid Maxi Protocol ）
10、适于从 100250ml 菌液中制备100-200 ug 高拷贝质粒涂板挑取单克隆菌落，入LB选择性培养基，37振摇8hr 后，取适量菌液（1/500-1/1000 ）入 100-250ml LB 选择性培养基（高拷贝100-250ml LB ，低拷贝 500ml LB ） ，37振摇 12-16hr；收获菌液， 4离心 6 000rpm（6 000g） 5min，弃尽上清；注意：在此步可将菌（离心沉淀）冻存于-20，留待以后操作。以 10ml P1 重悬细菌（ P1 中已加 RNase） ；加入 10ml P2，颠倒 46 次轻混，室温放置5min（轻混以免剪切基因组DNA ，并免长时间消化
11、） ；加入冰预冷10ml P3，迅速颠倒46 次轻混，冰上放置20min，以促进沉淀形名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 16 页 - - - - - - - - - 成；4离心 13 000rpm（20 000g 以上） 30min（离心前，应再次混合样品）；上清入新管，再次离心13 000rpm（20 000g 以上） 15min；第二次离心的同时，用10ml QBT 缓冲液平衡QIAGEN 柱，不需离心（重力引流） ；结合：快速移上清（第二次离心）入QI
12、AGEN 柱，使其在重力引流下进入树脂（resin） ；清洗： 30ml QC 洗 2 次（重力引流） ；洗脱： 15ml QF 缓冲液洗脱结合的DNA ，将洗脱液收集入新管（可将洗脱液暂时存放于 4数小时）；沉淀：加入10.5ml 异丙醇（室温，以免增加盐沉淀），混匀，立刻于4离心9 500rpm（ 15 000g）30min（离心前在管底作好标记，此步重要！） ，小心缓慢地倒出上清（以免弃去DNA 沉淀）；注意：此步如果DNA 沉淀不可见，可以1.5ml 75% 乙醇冲洗管底标记处，然后转移至 1.5ml 离心管， 15 000 rpm （20 000g）30min，此时沉淀往往可见，可重
13、复此步骤1 次，以收集尽可能多的质粒DNA 再清洗： 5ml 70% 乙醇（室温，以免增加盐沉淀）洗，离心9 500rpm（ 15 000g）10min，小心缓慢地倒出上清；空气中干燥沉淀5-10min ， 以适当体积的TE,pH8.0 或 10mM Tris-Cl, pH8.5 溶解 DNA 沉淀（注意冲洗管壁，过度吹打会剪切DNA 应避免）；琼脂糖凝胶电泳分析；质粒 DNA 浓度测定（紫外分光光度仪），OD260/OD280=1.61.8 。3.细胞培养常规方法3.1 293 细胞常规复苏、培养、传代及冻存 培养液配制： DMEM ，加入 NaHCO2 3.7g/L ，庆大霉素8 万u，调
14、 pH 至 7.0-7.2（比细胞生长所需终末pH 低 0.2-0.3） ，定容至 1L ，0.22um 过滤分装即可； 293 生长要求： DMEM ，含 2-10%的 FBS（按不同实验对细胞生长速度要求的不同而不同） ；名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 16 页 - - - - - - - - - 293 细胞的复苏：取液氮中冻存的细胞1 管，迅速置37水浴 1-3min 融化；转移至 10ml 离心管加入8ml DMEM 10% ， 轻轻吹打混匀，
15、低速离心 1000rpm，5min；弃上清，加入8ml DMEM 10%重悬细胞；转入25ml 培养瓶补足培养液，置 CO2孵箱 37、 5% CO2培养； 293 细胞的培养： DMEM 10% ； 293 细胞的传代（ 1：2-3） ：弃培养液， NS 或无血清培养液洗1-2 次，加入适量（数滴，或 1-3ml；按培养的293 细胞代数而定，代数低时，胰酶适当多加，反之，可能数滴即可）0.25%胰酶消化液， 37消化 1-3min，镜下观察消化情况，待细胞变圆、脱离瓶壁时，轻轻拍打瓶壁，使细胞完全脱离，加入适量培养液轻轻吹打使之分散；转入10ml 离心管，低速离心1000rpm，2-5mi
16、n ；弃上清，加入适量DMEM 10% 重悬细胞；转入适当大小培养瓶（1：2-3）并补足培养液，置CO2孵箱 37、5% CO2培养； 293 细胞的冻存： 取生长对数期的培养细胞，常规消化、 离心，细胞沉淀以1-2ml DMEM 10% 重悬，计数；重悬细胞10% DMSO 、40% FBS，以 DMEM 10% 补足体积，细胞终浓度为1106/ml；转入冻存管1.5ml/Tube ，封口膜封口，置-80冰箱 24hr；次日将细胞转入液氮，长期保存。3.2 L-O2 细胞的培养 L-O2 细胞生长要求：DMEM/1640 （1：1）混合培养液，含5-10% 的 FBS（按不同实验对细胞生长速
17、度要求的不同而不同）； L-O2 细胞的传代：比例1：3-5； 余基本同 293 细胞。3.3 细胞计数法 染色：常规消化、离心，弃上清，加入1 或 2ml 培养液，轻轻吹打重悬细胞，吸 20ul 细胞悬液，加入760ul NS ，加入 20ul 台盼蓝，混匀，置2-3min； 计数板：用 96%酒精冲洗计数板后，用擦镜纸擦净，另擦净盖玻片1 张，把盖片覆在计数板上，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液；名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 1
18、6 页 - - - - - - - - - 加稀释液：滴加1-2 滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中； 镜检：计算四大方格内细胞数，压中线者只计算左线和上线者； 计算公式：细胞数=4 大格细胞总数 /410 000稀释倍数；本法：细胞数 =4 大格细胞总数105； 按培养要求接种培养。4. RT-PCR 鉴定目的基因mRNA 的表达4.1 TRIzol 试剂提取培养细胞总RNA 的方法 弃培养液，不洗，直接加入1ml TRIzo l 试剂入 3.5cm 直径平皿，以枪尖轻划平皿数次；（加入的TRIzol 试剂量与培养皿的面积有关1ml/10cm2，而不依赖于存在的细胞数。过少的T
19、RIzo l 试剂，会导致分离的RNA 污染有 DNA 。 ） 加 TRIzol试 剂后混 匀 ,置室 温 5min ； （裂 解 后 ，在 加 氯仿 前， 样 品 可存于-60-70至少 1 个月） 分层：加 0.2ml 氯仿 /1ml TRIzol ，手中摇振15s，置室温 23min； 4离心， 12,000g，15min ； 仔细吸取上层水相，移至另一Ep 管中； 沉淀：加 0.5ml 异丙醇 /1ml TRIzol ，混匀，置室温10min； 4离心， 12,000g10min； （离心前， RNA 沉淀通常不可见） 弃上清，加1ml 75% 乙醇 /1ml TRIzol ，摇振，充
20、分洗涤沉淀，4离心， 7,500g5min； （RNA 沉淀在75%乙醇中， 2-8能保存至少1 周， -5-20至少能保存一年） 弃上清，空气干燥5-10min 后（ RNA 沉淀不能完全干燥，否则难溶），沉淀重悬于适量（ 10-30ul）无 Rnase 水中， -70保存备用。4.2 RT-PCR 鉴定目的基因的表达（Gibco/BRL SuperScript Firststrand Synthesis System ）逆转录反应cDNA 第一链的合成（随机引物法）：根据样品个数准备逆转录反应管：试剂数量名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - -
21、- - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 16 页 - - - - - - - - - 总 RNA（1ug/ul）2ul 六随机引物（50ng/ul）3ul 0.1%DEPC. 处理的 dd.H2O 3ul 总体积8ul 加热上述混合物至65， 10min，冰上冷却；短暂离心样品；每管中加入下列混合物试剂数量终浓度10逆转录酶缓冲液2 ul 125mM MgCl24 ul DTT(0.1M) 2 ul 0.01M 0.1%DEPC. 处理的 dd.H2O 1 ul Rnasin(40U/ul) 1 ul 1 U/ul dNTPmix(10mM) 1
22、ul 0.5 mM 终体积19ul 充分混匀，短暂离心后，置室温25， 2min；加入 1ul SuperScript RT 入各管，混匀，25， 10min；42水浴， 50min；70，15min，以灭活RTase终止反应，然后冰上冷却5min ；短暂离心后，加入1ul Rnase H 37 ， 20min；短暂离心后，样品保存于-80备用。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 16 页 - - - - - - - - - 腺病毒载体系统基本实验方法1.传统
23、碱裂解法抽提质粒小样（1）收菌： 2ml 菌液入 Ep 管，离心1min，弃上清；（2）重悬：加入200 ul 溶液(50mM glucose, 25mM Tris-HCl pH8.0, 10mM EDTA pH8.0), 旋涡振荡混匀；（3）裂解（冰浴）： 加入 200 ul 溶液(0.2N NaOH and 1% SDS), 轻柔颠倒混匀数次；（4）中和 （冰浴）：加入 200 ul 溶液(5M potassium acetate 60 ml, glacial acetic acid11.5 ml, and water 28.5ml) ，轻柔颠倒混匀数次；（5）最大速离心，3min（5-1
24、0min ） ；（6）转移上清入新管，加入500ul 异丙醇，混匀；最大速离心，5min；（7）弃上清，加入500ul 70% 乙醇旋涡振荡混匀，离心1min；（8）弃上清，晾干；（9）加入 50-70ul ddH2O 或 LoTE 重悬 DNA 。2.大规模制备质粒DNA（传统碱裂解法PEG 8000 纯化）适于从 100250ml 菌液中制备100-200 ug 高拷贝质粒涂板挑取单克隆菌落，入LB选择性培养基，37振摇8hr 后，取适量菌液（1/500-1/1000 ）入 100-250ml LB 选择性培养基（高拷贝100-250ml LB ，低拷贝 500ml LB ） ，37振摇
25、12-16hr；收获菌液， 4离心 6 000rpm（6 000g） 5min，弃尽上清；注意：在此步可将菌（离心沉淀）冻存于-20，留待以后操作。以 10ml 溶液重悬细菌；加入 10ml 溶液（新鲜配制） ，颠倒 46 次轻混，室温放置5min （轻混以免剪切基因组DNA ，并免长时间消化） ；加入冰预冷10ml 溶液，迅速颠倒46 次轻混，冰上放置20min ，以促进沉淀形成；4离心 13 000rpm（20 000g 以上） 30min（离心前，应再次混合样品）；名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整
26、理 - - - - - - - 第 9 页，共 16 页 - - - - - - - - - 上清入新管，再次离心13 000rpm（20 000g 以上） 15min；上清入新管，异丙醇沉淀：加入0.6 体积的异丙醇（室温，以免增加盐沉淀），混匀，于室温放置10min ，4离心 9 500rpm（15 000g）30min（离心前在管底作好标记），小心缓慢地倒出上清（以免弃去DNA 沉淀）；清洗： 20ml 70% 乙醇（室温，以免增加盐沉淀）洗，离心9 500rpm（ 15 000g）10min，小心缓慢地倒出上清；空气中干燥沉淀5-10min ，以适当体积的（2.5ml）TE,pH8.0
27、 （含无 DNase 的Rnase 20ug/ml）溶解 DNA 沉淀，于室温放置30 分钟，分装500ul/Ep 管；回收质粒：加500ul 含 13%（w/v）PEG8000 的 1.6M NaCl，充分混合， 4，12 000g 离心 5min；弃上清，用400ul TE （pH 8.0）溶解质粒DNA 沉淀。用等体积酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次；将水相转入新管，加100ul 10M 乙酸铵，充分混合，加2 体积无水乙醇，于室温放置 10min，4， 12 000g 离心 5min，以回收沉淀的质粒DNA ；弃上清，加200ul 处于 4的 70%乙醇，稍加振荡，4， 12 000g 离
28、心 5min；吸去上清，敞开管口，凉干；以适量LoTE（pH 8.0 ）溶解沉淀；琼脂糖凝胶电泳，酶切鉴定。3. 293 细胞包装重组腺病毒 转染前 24hrs，293（腺病毒E1 区基因转化的人肾细胞）细胞常规传代，T-25培养瓶， 2106/瓶，转染前应为50-70% 融合； 转染当天， Pac酶切重组腺病毒质粒（通常4ug DNA 能满足转染要求） ，等体积酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，重悬于适量（20-50ul ）无菌 dd.H2O； 经典磷酸钙共沉淀法转染质粒DNA （转染前后更换培养液）； 使用 pAd-Track-CMV载体质粒时， 可通过观察GFP 的表达来监测转染和病毒的产生，转染
29、后2w，常规显微镜下不易观察到明显的CPE 及 Plaque 的形成，然而 Plaque 在荧光显微镜下却总能观察到； 转染后 7-10 天，收获细胞， 细胞沉淀重悬于2ml PBS 或 Ad Buff ，干冰 /37水浴冻融细胞，旋涡剧烈振荡，再连续冻融3 次（共 4 次） ，注意尽量不要使名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 16 页 - - - - - - - - - 病毒上清温度升高，短暂离心后收集上清（第一代重组腺病毒P1）置-20 保存； 加入 3
30、0-50%上述病毒上清 /T-25 瓶，感染 2 个 50-70%融合的 T-25 瓶，感染后2-3 天可见较明显的CPE 或细胞裂解，使用Ad-Track 载体时，能方便的观察到感染的产生； 感染后 3-5 天，当 1/3-1/2 细胞漂起时，可以收获病毒，重组病毒的存在可用Western blot 和/或 PCR 证实； 收获细胞，冻融法裂解细胞，收集含病毒上清（P2） 。在次步，通常能得到至少 107感染单位 /ml。每个扩增周期，至少能获得上一周期10 倍的病毒； 进一步扩增，可重复感染293 细胞，加入30-50%上一步扩增获得的病毒上清/T-75 瓶，感染 2 个 50-70%融合
31、的 T-75 瓶（P3） 。可以随时测定病毒滴度，使用 Ad-Track 载体时，这一点就特别方便：用不同稀释度的病毒上清感染293细胞， 18 小时后在荧光显微镜下观察绿色（表达GFP）细胞的数目。4. PCR 鉴定重组病毒的存在7.1 提取病毒基因组DNA （QIAGEN Blood and Body Fluid Spin Protocal） 吸取 20ul QIAGEN 蛋白酶入 1.5ml 离心管； 消化：加入200ul 样品（细胞裂解粗提物第 3 代病毒），混匀；（如样品体积200ul 时，如 400ul，则 QIAGEN 蛋白酶、 AL buff 加倍，为40ul、 400ul）
32、56水浴 10min ， （长时间水浴对DNA 的纯度、产量无大影响）； 水浴后短暂离心，使液体集中管底； 沉淀：加入200ul 无水乙醇，充分振荡混匀15sec，短暂离心，使液体集中管底； （样品体积 200ul 时， 无水乙醇量相应加倍，400ul 样品，400ul 无水乙醇）； 将混合物转入QIAamp 柱（ 不要弄湿管壁） ，盖上盖 （以免气溶胶形成，交叉污染），离心 10 000rpm，1min；将柱子转入一新收集管； 轻轻打开柱子盖，加入500ul Buff AW1 （不要弄湿管壁） ，盖上盖， 离心 10 000rpm，1min；将柱子转入一新收集管；（样品量大时，Buff AW
33、1 亦不需加量）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 16 页 - - - - - - - - - 轻轻打开柱子盖，加入500ul Buff AW2 （不要弄湿管壁） ，盖上盖， 离心 15 000rpm，3min；勿使过滤 液碰到柱子，如不慎碰到，则要换新管，再次最高速离心 1min； 洗脱：将 QIAamp 柱放入一新的1.5ml 离心管，谨慎打开柱子盖，加入200ul Bffer AE 或双蒸水，室温放置5min，离心 10 000rpm， 1min。注
34、意：a.减少 Buff AE 或双蒸水体积能提高DNA 浓度，但会使DNA 总产量有轻度减少；b.当样品 DNA 含量少于 1ug 时，推荐加50ul Bffer AE 或双蒸水；c.200ul 人全血，能抽提得到6ugDNA/200ul溶液体积。7.2 常规 PCR 鉴定重组病毒中外源基因的存在（略）5.制备高滴度的重组腺病毒 293 细胞常规传代至T-75 培养瓶，感染腺病毒时细胞约90%融合（1107/T-75瓶） ； 感染 293 细胞 MOI=5-10 PFU/cell 。当所有细胞变圆，约1/2 细胞漂起时（通常感染后 3-4 天） ，收获细胞， 500g，离心 5min，移去上清
35、； 在适量 Ad Buff （1-4ml ）中重悬细胞沉淀，-80冻存以备下一步纯化（参见9.） 。6.氯化铯不连续密度梯度离心法纯化腺病毒纯化前 1 天准备工作 2 次冻融裂解细胞； 消毒灭菌 50ml 离心管、 1000ml 烧杯，透析袋； 透析液（ Ad buffer ：10mM Tris pH 8.0 ，2mM MgCl2，5%蔗糖），高压灭菌； 20%PEG8000/2.5M NaCl ，高压灭菌； CsCl（1.1、1.3、1.4g/ml ） ，以灭菌20mM Tris （pH8.0）配制。纯化步骤 细胞第 3 次冻融后， 4， 12 000g10min，取上清；名师资料总结 -
36、- -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 16 页 - - - - - - - - - 每 20ml 上清中加入10ml 20%PEG8000/2.5M NaCl ，混匀后冰浴1hr； 4， 12 500g30min，弃上清； 沉淀溶于 5ml 1.1g/ml CsCl中（沉淀较难溶，应有耐心）； 4， 8 000g5min，取上清（此步于管底可见少量白色沉淀）； 制备不 连续 CsCl 密度梯 度：缓 慢轻柔 地依 次加 入 2ml 1.4g/ml CsCl 、3ml 1.3g/
37、ml CsCl 、5ml 上清； BECKMAN SW41 转 子，4 ，60 000g（ 20 000rpm） 2hr， 吸出病 毒带（1.3-1.4g/ml 密度之间的蓝白色条带）； 转入经过预处理的透析袋，仔细封口后，入Ad buffer 透析液（透析液的选择基于病毒最终用途，Ad buff（10mM Tris pH 8.0，2mM MgCl2，5%蔗糖）允许病毒浓集至11013VP/ml ，并且提 供非常好 的稳定性 ）4透析 （透析膜MWCO=25KD ，而病毒分子量在兆Dalton 范围，大小约90nm） ，使用 200 体积（病毒条带体积）的透析缓冲液，透析1hr 后更换透析液；
38、在更换3 次透析液后，将无痕量CsCl 残留；透析后以0.45um 一次性滤器过滤后分装保存； 透析后的病毒于-80可长期保存，于-20只能短暂保存；反复冻融后Ad 的感染活性将降低，应以适当的体积分装，以方便将来使用； 透析后，如病毒太稀释， 可使用 Millipore浓缩柱浓缩病毒 （可浓缩10 倍以上）。 溶液配制：1. CsCl 溶液 ：用灭菌20mM Tris （pH8.0 ）配制密度（ g/ml）浓度质量 ( g ) 终体积（ ml）1.4 56% 7.84 10 1.3 31% 4.03 10 1.1 12% 1.32 10 2. 20%PEG8000/2.5M NaCl ：Na
39、Cl 29.22g ，PEG8000（w/v）40.00g，以 dd.H2O定容至 200ml。7.TCID50法测定腺病毒滴度（昆腾公司用于测定腺病毒滴度的标准方法）此方法基于最高稀释度（极限稀释法）下在QBI-293A 细胞中 CPE 的形成，它是名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 16 页 - - - - - - - - - 昆腾公司用于测定滴度的标准方法。细胞的准备 收集一瓶 QBI-293A细胞，计数； 用 DMEM 2-5% 准备 20ml 10
40、5/ml 细胞； 用 12 道排枪在 2 块 96 孔板中每孔加入100ul 细胞悬液。注：每个病毒应用复板（两块96 孔板），病毒感染紧随细胞准备之后进行。病毒稀释液的准备（表1.） 第 1 管中加入 0.99ml DMEM 2%，其余加入1.35ml。第 1 管中再加入10ul 病毒储备液（为节省病毒原液，只用10ul 病毒原液，而稀释度直接从10-2开始，事实上仍为从100ul 病毒原液开始10 倍稀释）； 上下吸打 5 次混匀； 换用新枪头； 从第 1 管中吸取150ul 加入第 2 管中； 反复稀释至最高稀释度；（共 12 管，含第 1 管，每管间10 倍稀释）表 1：病毒稀释法管号
41、1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 病毒原液（ul）10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 前一管病毒稀释液（ul）0 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 DMEM 2% （ ml）0.99 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 稀释度10-210-310-410-510-610-710-810-910-1 010-1 110-1 210-1 3 用同一管病毒储备液进行第2 轮稀释（用于复板） ； 取最后 8 个稀释液加入96 孔板，每孔0.1
42、ml，每个稀释度10 孔，最后 2 孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml DMEM 2% 监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。 37培养 10 天； 10 天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE 的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE 即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。 计算每一排中出现阳性的孔数。如果阴性对照中无任何CPE 且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1
43、4 页，共 16 页 - - - - - - - - - KARBER 统计法计算病毒滴度附例： TCID50的典型结果（表2.）在这一例子中， 当稀释度为10-6时出现 100%阳性，当稀释为 10-9时出现 0%阳性。因此，滴度可以用KARBER 统计法精确算出：对于 100ul 的病毒储备液，滴度为T=101+d（s-0.5）d=log10稀释度 =1（对于 10 倍的稀释度而言）s= 阳 性 比 率 之 和 （ 从 第1个10倍 稀 释 度 ， 即10-1， 开 始 ）=1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0=6.8 。虽然一些低稀释度在测定中省略了（如10-1和 10-2）
44、，但在计算时仍应以阳性比率为 1 来算。滴度： T=101+1（6.8-0.5）=107.3（100ul 病毒储备液中）T=100.32108 TCID50/ml。说明：已经证实，TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7。将 TCID50/ml 转换为 PFU/ml ：T=1108.3 TCID50/ml=1108.3-0.7 PFU/ml=1 107.6 PFU/ml 4107 PFU/ml 。两次重复试验（复板）得到的滴度值应相差0.7 个 log10值（100.7） 。表 2： TCID50的典型结果稀释度孔对 照1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
45、10-10A 10-9B 10-8C 10-7D 10-6E 10-5F 10-4G 10-3H ：CPE 阳性 ： CPE 阴性结果（每排阳性比率）稀释度比率名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 15 页，共 16 页 - - - - - - - - - 10-100/10=0 10-90/10=0 10-82/10=0.2 10-76/10=0.6 10-610/10=1 10-510/10=1 10-410/10=1 10-310/10=1 10-210/10=1 10-110/10=1 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 16 页，共 16 页 - - - - - - - - -