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1、 目 录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 4 研究论文 Nrf2 在液压冲击脑损伤抗神经细胞凋亡中的作用 前 . 8 材料与方法 . 8 .19 關 . 21 赚 . 28 i 寸 i 仑 . 31 会吉 i 仑 . 33 参考文献 . 34 综述继发性颅脑损伤发病机制的研究进展 . 37 至夂 i 射 . 52 个人简历 . 53 Nrf2 在液压冲击脑损伤抗神经细胞凋亡中的作用 摘 要 目的：观察 Nr2 基因敲除小鼠液压冲击脑损伤后水肿脑组织中凋亡蛋 白 Casepase-3、 Casepase-12 表达变化和神经细胞凋亡改变，探讨 Nr2 在 液 压冲击脑损伤中所发挥的抗神经细胞凋亡
2、作用。 方法：用雄性 Nr2 基因正常和基因敲除小鼠制作液压冲击脑损伤模 型。选取成年小鼠 32 只，其中 Nr2+/+、 NrJ各 16 只，体重约 28-32g,随 机 分为 4 组： Nr2+/+对照组（ Nr2+/MC 组， n=8)、 Nr2+/+损伤组（ Nr2+/+TBI 组， n=8)和 NrT对照组（ NrTNC 组， n=8)、 NrT损伤组（ NrGTBI 组， n=8)。其中，对照组仅头颅开窗不进行液压冲击损伤；损伤组头颅 开窗并 常规制作液压冲击脑损伤模型。 各实验组小鼠于 24h 后采用神经功能缺损评分（ NSS)方法进行评分， 然后过度麻醉，断头，留取组织标本。迅
3、速从损伤区前缘取重约 50mg 水 肿 脑组织，采用干湿重法测量脑组织含水量；经损伤区切成约 4mm 薄层 冠 状脑组织，用多聚甲醛固定，采用 HE 染色观察组织形态学变化；免疫 组 织化学染色方法检测 Caspase-3、 Caspase-12 的表达；原位末端荧光标记 (TUNEL)法检测神经细胞的凋亡情况；取损伤区域后缘脑组织采用免 疫 蛋白印迹法（ WesternBlot)检测 Caspase-3、 Caspase-12 蛋白含量。 结果： 1 神经功能缺损评分 脑损伤后，小鼠出现了神经功能缺损症状。与对照组（ NC)比较，损伤各组（ TBI) 在损伤后 24h 神经功能评分明显高于对
4、照组，差异有统 计学意义（ P0.05)。 2 组织学观察 Nr2+/MC 组和 Nr2_ANC 组肉眼观察 :脑组织软脑膜完整表面光滑，脑 沟及脑回清晰可见，脑表面及颅底无挫伤、出血、充血等表现。镜下观 察： 脑组织细胞结构完整，排列有序，核膜完整，核仁蓝色淡染。 Nr2+/+TBI 组和 NrfTATBI 组肉眼观察：可见打击侧皮层局部挫伤， 2 脑沟回存在积血，切面观察可见皮层下有散在点状出血，严重者可见脑室 内 出血。镜下观察：挫伤灶周围细胞出现水肿且水肿程度明显，胞浆淡染 , 部 分出现空泡样变性伴胶质细胞增生。 3 脑组织含水量测定 采用 Elhot 公式对小鼠脑组织含水量进行测定
5、。与对照组相比，损伤 各 组小鼠脑组织含水量明显增高； Nr2+/+NC 组（ 78.370.18)与 NrTNC 组 （ 78.320.13)比较无差别（尸 0.05) , Nr2+/+TBI 组（ 81.550.40)与 NrJTBI 组（ 82.890.20)之间有明显差别（ PO.05)。 4 免疫组化技术检测 Caspase-3 和 Caspase-12 表达 Nr2+/MC 组和 Nrf-NC 组小鼠 Caspase-3 和 Caspase-12 阳性细胞 很 少， Nr2+/+TBI 组和 NrTTBI 组小鼠则明显增多。与 Nr2+/+NC 组比较， Nr2+/+TBI 组 动
6、 物 挫 伤 灶 周 围 脑 组 织 内 Caspase-3 (28.8925.865 ), Caspase-12 (28.6192.547)阳性细胞明显增多，且染色也较深（尸 0.05). 2 Histological observations Nr2+TSTC group and Nr2/_NC group Naked eye: the brain surface is smooth, groove back clearly visible, the surface of brain and skull base no bruising, bleeding, congestion and
7、other symptoms. Microscopic observation: the structural of brain tissue integrity, cells arranged in order, nuclear membrane integrity and nucleolus light blue. Nr2+/+TBI group and Nr2_/TBI group Naked eye： Visible the cortical of impact side was contusion, the brain sulcus hematocele, section obser
8、vation showed subcortical scattered spotting， severe cases intraventricular hemorrhage. Microscopic observation: the cells around contusion appeared edema and significant visibled, lightly stained cytoplasm was observed, someone had vacuolar degeneration, accompanied by the proliferation of glial ce
9、lls. 3 Brain water content Elliot formula was used to measure the brain water content. Compared with those of NC group, the brain water content of animals from each TBI group significantly higher; there were no statistical difference in brain water content between Nr2+/+ NC group (78.370.18) and Nr2
10、/_ NC group (78.32 士 0.13) (P0.05); however, there were obvious statistical difference betweenNrf2+/+TBI group (81.55 士 0.40) and Nr2_/_TBI group (82.89 士 0.20) (P0.05)。（见 Table3) 2 组织病理学观察 Nr2+/+NC 组和 NrTNC 组肉眼观察：脑组织软脑膜完整表面光 滑， 脑沟及脑回清晰可见，脑表面及颅底无挫伤、出血、充血等表现。镜 下观 察：脑组织细胞结构性完整，细胞间排列有序，核膜完整，核仁蓝色 淡染。 Nr
11、2+/+TBI 组和 NrTTBI 组肉眼观察：脑组织表面可见打击侧皮 层 局部挫伤，脑沟回积血，切面观可见皮层下有散在点状出血，严重者可 见 脑室内出血（见 Flg.2)。镜下观察：脑组织完整性被破坏，局部可见出 血 灶，细胞结构排列紊乱，周围脑组织细胞水肿、间隙增宽，部分细胞坏 死 呈空泡状改变，炎症细胞浸润伴胶质细胞增生。（见 Fig.3， Fig.5) 3 脑组织含水量的测定 采用 Elhot 法对脑组织含水量进行计算。基因正常小鼠与基因敲除小 鼠 比较， NC 组分别为 78.370.18、 78.320.13, TBI 组分别为 81.550.40、 82.890.20, NC 组
12、与 TBI 组之间比较差异有统计学意义 （ PO.05); NrJTBI 组与 Nr2+/+TBI 组两组之间比较差异有统计学意义 （ PO.05)。 (见 Fig.4， Table4) 4 免疫组织化学检测 Caspase-3 和 Caspase-12 Nr2+/MC 组和 NrfNC 组小鼠 Caspase-3 和 Caspase-12 阳性细胞很 少， Nr2+/+TBI 组和 NrTTBI 组小鼠则明显增多。与 Nr2+/+NC 组比较， Nr2+/+TBI 组 动 物 挫 伤 灶 周 围 脑 组 织 内 Caspase-3 (28.8925.865 ), Caspase-12 (28
13、.6192.547)阳性细胞明显增多，且染色也较深（尸 0.05 Table 4 the brain water content at 24th in different groups (x 士 s， ) 对照组 损伤组 Nr2+/+组 NrT/- 组 78.370.18 78.320.13# 81.550.4 x 82.890.20 与对照组比较， PO.OS; 与 Nr2+/+损伤组比较， PO.OS #与 Nr2+/+对照组比较， 户 0.05 Table 5 The Caspase-3 expression at 24h in each groups by Immunohistoche
14、mistry staining (x 士 s， ) 对照组 损伤组 Nr2+/+组 0.2940.290 28.8925.865 Nr2 组 0.3010.298# 56.8845.819A 与对照组比较， PO.OS; 与 Nr2+/+损伤组比较， PO.OS #与 Nr2+/+对照组比较， 户 0.05 Table 6 The Caspase-12 expression at 24h in each groups by Immunohistochemistry staining (x 士 s， ) 对照组 损伤组 Nr2+/+组 Nr2 牟组 0.3000.288 0.3090.326#
15、28.6192.547 51.1964.563 与对照组比较， PO.OS; 与 Nr2+/+损伤组比较， PO.OS #与 Nr2+/+对照组比较， 户 0.05 30 Table 7 The Apoptosis Index changes by TUNEL assay (x 士 s， ) Nr2+/+组 对照组 0.700.52 损伤组 31.115.31 NrT组 0.870.69# 59.309.90A 与对照组比较， PO.OS; 与 Nr2+/+损伤组比较， PO.OS #与价 2 +/+对照组比较，户 0.05 Table 8 The Caspase_3 expression a
16、t 24h by Western Blot (x 士 s) Nr2+/+组 对照组 0.63120.0182 损伤组 0.88570.0226 NrT组 0.65740.0423# 1.08940.2479A 与对照组比较， PO.OS; 与 Nr2+/+损伤组比较， PO.OS #与价 2 +/+对照组比较，户 0.05 Table 9 The Caspase-12 expression at 24h by Western Blot (x 士 s) 对照组 损伤组 Nr2+/+组 0.32760.0545 0.63270.0080 NrT组 0.33680.0522# 1.02900.142
17、1A 与对照组比较， PO.OS; 与 Nr2+/+损伤组比较， PO.OS #与价 2 +/+对照组比较，户 0.05 31 讨 论 创伤性脑损伤 （ Traumatic brain injury， TBI)是由突然的冲击，惯性 力的改变，穿透伤，缺氧和有毒的代谢障碍，大脑的血管损伤等所造成损 伤 的一个总称。对创伤性脑损伤产生的原因和随后结果的分析，传统上认 为 有两个阶段：（ 1)原发性损伤 -即上述变化，（ 2)继发性损伤 -由原发性 损伤 造成的脑组织病理和生理学的变化，包括兴奋性毒性和能量衰竭，局 部缺 血，水肿，细胞凋亡，迟发性轴索损伤和炎症等 5。随着国家经济的 发展， 创伤性
18、脑损伤成为致死率和致残率较高的主要疾病之一。创伤性脑 损伤带 来的后果从医疗问题和致残率方面不仅严重影响家人、朋友、社区 及社会， 而且还严重地影响了患者身心健康 6。然而对脑损伤发病机制的 研究并不 是很明确，亟需解决。 继发性脑损伤所致的机体细胞凋亡是人类颅脑损伤后致死率和致残 率 主要原因之一，因此深入了解继发性脑损伤的机制可作为新的切入点， 探 索出一种新的治疗方法，对改善患者预后有重要意义。研宄表明创伤性 脑 损伤可导致大脑的灰质白质结构受损，其中以少突胶质细胞损伤更为严 重， 损伤后 Caspase-3,酪氨酸激酶受体 B (TrkB)及胶质纤维酸性蛋白 表达增多， 而且这些基因在
19、小脑中表达更为明显 7。损伤区域的少突胶质 细胞凋亡可 能与 Caspase-3 数量增加有关 8。另外研究表明 Caspase-3 阳性 细胞在退化 的创伤性脑组织神经元中表达显著增加，并且应用咖啡酸苯乙 酯 (CAPE,抗 癌药物 )能够有效地预防因创伤诱导的氧化反应 9,因此以细 胞凋亡作为研 究突破点，预防由外伤引起少突胶质细胞的凋亡及其随后发 生的神经脱髓 鞘反应和传导障碍，能有效地降低致残率和死亡率。 本实验研究发现液压冲击脑损伤后小鼠出现神经功能受损，脑组织含 水量增多，且 Caspase-3 和 Caspase-12 表达情况也明显增多，与吴燕川、 Badiola N 等研究证
20、实在缺血性脑损伤情况下 Caspase-12 的表达明显增加 1_11相符。 细胞凋亡是生物体内的一种程序性死亡，它是脊椎动物决定神经系统 细胞大小、形状和功能的一个重要机制。引发细胞凋亡主要包括非 Caspase 家 族依赖性 12和 Caspase 家族依赖性两种通路，且以 Caspase 家族依赖性 通路 为主 13。根据起始蛋白的不同可分为 3 种： Fas/FasL 介导的外在死 32 亡受体通路，通过激活 Caspase-8 继而激活下游的基因序列，通过裂解细 胞 导致细胞凋亡；另外发现活化的 Caspase-8 也可以激活线粒体介导的内 在凋 亡通路。 线粒体介导的内在凋亡通路，
21、受到凋亡信号的刺激，细胞 色素 C 从线粒体内膜上游离后释放到胞质中， 在胞质内与凋亡活化因子 -1 (Apaf-1)竣基端结合， Apaf-1 序列的氨基端再与 Pro-Caspase-9 结合， 结合 后形成凋亡复合体致使 Caspase-9 活化，活化的 Caspase-9 进而激活 下游的 Caspase-3、 6、 7 等基因序列，诱导细胞凋亡 14。 内质网介导的 凋亡通路， 一种新的细胞凋亡通路。内质网被诱导后通过调节蛋白质的合 成和细胞内 钙离子的平衡来调控细胞凋亡。持续的内质网应激（ ERS)可 导致细胞内钙 离子的浓度增加并随后激活 M-钙蛋白酶，活化的 M-钓蛋白 酶可裂
22、解抗凋 亡蛋白及激活 Caspase-1215。 Caspase-12 是 Caspase 家族中 唯一存在内质网 中的蛋白酶。正常情况下以前体酶原的形式存在，活化后 从胞浆转移到细 胞膜上，是 ERS 介导的细胞凋亡通路中关键启动因子且 仅可被 ERS 信号激 活，活化后可激活 Caspase-9,继而激活下游序列。 Caspase-3 是 Caspase 家 族中细胞调亡的最终执行者，在细胞调亡中起关 键作用。活化的 Caspase-3 作用于不同底物，水解特异性蛋白，最终导致 细胞不可逆性地死亡 16，故 被称为 “死亡蛋白 ” 17。尽管许多重要的凋亡蛋 白已被证实，但对凋亡机制 的掌
23、握有限，因此对治疗颅脑外伤仍然是一项 艰巨的任务， Caspase-3 和 Caspase-12 在细胞凋亡过程中发挥着重要的作 用，是细胞凋亡机制中的重 要扮演者，因此本实验将这两个因子作为研究 的对象。 Nr2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)，属于碱性亮氨酸拉链 Cap Collar 家族的核转录因子，是控制和协调编码解毒酶，药物转运蛋 白， 抗炎蛋白，抗细胞凋亡蛋白和蛋白酶体等基因表达的一组诱导基因， 几乎 在各种细胞内均可表达。研究表明在正常状态下，在细胞质中因为抑 制剂 Nr2)的存在， Nrf2 处于不断的动态平衡状态，然而
24、当发生氧化 应激或其 他外界刺激时， Nr2 从胞质转入细胞核内，启动相关序列调控 上述蛋白， 降低体内游离亲电子体和活性氧，增加基因稳定性，抑制基因 突变，从而 发挥减轻炎症，降低氧化，抑制细胞凋亡和抗癌作用 18。另外 Nr2 也可通 过上调半胱氨酸膜转运体；增加细胞内的 GSH 水平来发挥抗 凋亡作用。 GSH 可能通过调节体内凋亡调控基因 Bd-2 家族蛋白的表达来 33 抑制细胞凋亡。近年来 Calkins MJ 等研究发现颅脑外伤后， Nr2 通路被 激 活，通过调节胶质细胞的活化 19，在颅脑外伤中起到一定的保护作用 2Q; 细胞内的 Nrf2 表达也可通过抗氧化作用来降低神经脊
25、细胞内乙醇诱 导的氧 化应激和凋亡 21; Cheng ZG 等发现， Nrf基因型小鼠抗氧化能 力明显降低 22。 Nr2 诱导剂 -叔丁基对苯二酚（ tBHQ)或转染过 Nr2 基 因的细胞通过 激活抗调亡蛋白 Bcl-xl 的表达，抑制调亡蛋白 Bax 的表达 和减少 Caspase-3、 Caspase-7 的激活，从而抑制了细胞凋亡 23，同时应用 诱导剂（ tBHQ)可能 通过提高热休克蛋白 (HSP70)在海马区域的表达，提 高了中度脑损伤下的认 知功能和降低了活化 Caspase-3 的水平 24;应用褪 黑素通过激活 Nr2/ARE 通路 25和增强细胞自噬作用，减少内在的线
26、粒体 凋亡途径 26，进而能够有 效地降低早期蛛网膜下腔出血颅脑损伤模型中神 经细胞的凋亡。然而 Nr2 基因是一把双刃剑。一方面 Nr2 基因可以调节 和协调保护性基因的表达， 有助于保护细胞和发挥抑制炎症、肿瘤形成、 神经退行性病变的作用；另 一方面持续的细胞核内 Nr2 的激活和 /或聚积 , 可诱导肿瘤的形成和增加药 物抵抗 27。 Nr2 抑制剂 Nrf2)缺失的老鼠 会因细胞核内 Nr2 的过度表达， 导致食管和胃窦部细胞的过度角化造成 营养不良而死亡 28。 本实验通过利用 Nr2 基因敲除小鼠制作液压冲击脑损伤模型，观察 脑 损 伤 后神 经 细 胞凋 亡 的 情 况， 结 果
27、 显 示液 压 冲 击脑 损 伤 后 脑组 织 内 Caspase-3 和 Caspase-12 表达明显增多，且神经细胞出现凋亡现象，损伤 组 较对照组表达明显增高；同时 Nr2 基因敲除小鼠的凋亡情况较 Nr2 基 因 正常组小鼠表现较重，具有统计学意义。因此可以推测 Nr2 基因在液 压冲 击脑损伤中发挥着重要作用，可以通过抑制 Caspase 蛋白凋亡途径在 神经 细胞凋亡过程中发挥着保护作用，进而为脑损伤提供了新的治疗策 略。 结 论 1 野生型（ Nr2+/+)小鼠液压冲击脑损伤后水肿脑组织内 Caspase-3 和 Caspase-12 表达增多，神经细胞凋亡加重，提示液压冲击脑
28、损伤后 Caspase-3 和 Caspase-12 上调表达，诱导神经细胞凋亡。 34 2 液压冲击伤后 Nr2 基因敲除型（ NrfT)小鼠脑损伤后 Caspase-3 和 Caspase-12 表达和神经细胞凋亡明显高于野生型（ Nr2+/+)小鼠，表明 Nr2 基 因可通过抑制 Caspase 依赖凋亡途径，发挥抗神经细胞凋亡的神经保护 作用。 参考文献 1 Arifin M Z? Faried A, Shahib M N? et al. Inhibition of activated NR2B gene-and caspase-3 protein-expression by glut
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