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1、本科毕业设计(论文)外文翻译 华南理工大学 本科毕业设计（论文）翻译 班级 姓名 学号 指导教师 填表日期 中文译名水溶性过度金属咔咯配合物对DNA连接和氧化裂解的作用 外文原文名DNA Binding and Oxidative Cleavage by a Water-soluble Carboxyl Manganese(III) Corrole 外文原文版出处Chinese Journal of Chemistry,2022,V ol.31(10) 译文： 吸收光谱，荧光光谱和CD光谱，以及粘度测量已经研究了小牛胸腺DNA(ct-DNA)与锰的咔咯配合物5,10,15-三(4-羧基苯基)咔
2、咯的相互作用。结果表明锰的咔咯配合物通过外部沟与ct-DNA结合，该结合常数K b为4.67104 L?mol?1 。在多种氧化剂存在下，由Mn III TCPC作用，ct-DNA裂解作用也被研究。在过氧化氢或叔BuOOH存在下，Mn III TCPC 可以以缺口和线性形式切割超螺旋质粒pBR322，然而以KHSO5作为氧化剂却并没有观察到核酸酶的活性。抑制剂试验表明，羟基自由基，单线氧没有参与Mn III TCPC为介质的DNA氧化裂解。在这种氧化裂解反应中，氧代锰(V)的咔咯配合物是可能的活性中间体。关键词：咔咯，锰，DNA联接，核酸酶活性 引言 在自然中，经由水解磷酸二酯是金属酶催化的D
3、NA高效裂解的途径。在过去几十年里，作为探索生物医药的工具和抗癌药物，旨在结合并切割DNA的过渡金属配合物已被广泛研究。卟啉及其金属配合物在生命系统中无处不在并发挥了重要的作用，例如细胞色素P450，过氧化物酶和过氧化氢酶。为追求潜在的应用，在光动力疗法，肿瘤显像，人工核酸酶中，许多水溶性卟啉，如阳离子型卟啉，磺化卟啉，羧酸卟啉已经合成，它们中的一些甚至被用在临床诊断和治疗中。类似的研究已扩大到其他类似卟啉的分子。咔咯大环化合物与卟啉是有许多相似之处。咔咯金属配合物的许多性能与卟啉的比较已经引起了人们极大的兴趣。 水溶性磺化咔咯及其金属配合物的合成可以被视为咔咯在生物无机化学的最有价值的应用。
4、磺化咔咯可以与人血清白蛋白(HSA)和转铁蛋白紧密结合，而且，它是白蛋白共轭铁与锰配合物产生的一个非常简单却非常有效的仿生氧化系统。以前的工作证明，该磺化咔咯可以与小牛胸腺DNA(ct-DNA)通过外部结合模式绑定并且表现出氧化裂解或光切割pBR322DNA的活动。阳离子吡啶基取代咔咯形成另一个类水溶性咔咯。这种带正电的咔咯可以稳定G-四链体DNA并由于具有良好的核酸酶活性而表现出的与带负电负的DNA更好的亲和力，锰(III)配合物在KHSO5存在下与非双螺旋区选择性作用，并且能选择性地靠近双链DNA环形及凸起部位的鸟嘌呤。 羧基卟啉已明显表现出与DNA结合和裂解的良好活性。与此相反，水溶性羧
5、基咔咯化合物与DNA的相互作用仍未报道，而且，由锰的咔咯配合物引起的DNA氧化裂解机制仍 不清楚。本论文要阐述锰的咔咯配合物5,10,15-三(4-羧基苯基)咔咯及其与ct -DNA的相互作用，以及通过凝胶电泳实验证明，在氧化剂的存在下，其对pBR322DNA的氧化裂解活性，所采用方法已显示在方案1中。 方案一锰的5,10,15-三（4-羧基苯基）咔咯的合成 实验 所有购买的试剂，均为分析纯并且未经进一步纯化而使用。小牛胸腺DNA买自Sigma-Aldrich，pBR322DNA购买自上海生工公司。三羟甲基甲氨(Trisbase)，溴化乙锭(EB)，氯化钠，硼酸酸，二甲亚砜(DMSO)，30过
6、氧化氢(H2O2)，琼脂糖凝胶加 样缓冲液，和乙二胺四乙酸(EDTA)均来自购买。所有水溶液由去离子水制备。小牛胸 腺DNA的储液（贮存于4和所用时间不超过5天），制备缓冲液I与ct- DNA溶液， ct-DNA的浓度根据其在260 nm处的吸光度和摩尔消光系数值(6600 M-1cm-1)进行计算。若A260/A280介于1.8和1.9之间，说明该DNA溶液蛋白质含量足够低，无需做进一步处理。缓冲溶液I(5 mM Tris/ 50 mM NaCl, pH=7.2)，所有涉及到ct-DNA的实验均在该溶液中进行。缓冲溶液II(50 mMTris/ 18 mM NaCl, pH= 7.4)，配合
7、物的核酸酶活性研究反应在此溶液中进行。缓冲溶液III(89mM Tris/ 89 mM H3BO3/ 2 mM EDTA，pH =8.3)，凝胶的制备和电泳液均使用该TBE电泳缓冲溶液。 物理测量 Hitachi(日立) 3900H 型紫外可见光谱仪；Hitachi(日立) F-4500荧光分光光度计；JASCO(日本分光) J-810圆二色光谱仪；乌氏粘度计；北京六一31-CN凝胶电泳仪；Bio-rad 凝胶自动成像分析仪。 5,10,15-三(4-甲氧基羰基-苯基)咔咯的合成 在250mL圆底烧瓶中加入200 mL 甲醇/ 水(体积比1 :1)，820 mg 4-(甲氧基羰基)苯甲醛(5m
8、mol)和670 mg吡咯(10 mmol), 完全溶解后加入2.1 mL 37% HCl(0.25mmol)溶液，室温下搅拌反应3 h；反应结束后用DCM萃取, 收集有机相并水洗3 次,用Na2SO4干燥后过滤, 加入1 g DDQ反应45min。按照方法一中步骤纯化，得纯净产物220 mg，产率达19%。UV-Vis (CH2Cl2) max: 420,581, 617,647 nm; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : 8.73(s, 4H), 8.59 (s, 6H), 8.45 (d, J 12 Hz, 4H), 8.33 (s,4H), 8.18 (s, 2H),
9、3.37 (s, 9H); ESI-MS (THF, negative)m/z : 699.1 M ?H? 锰(III)的5,10,15-三（4-甲氧基羰基-苯基）咔咯的合成 将5,10,15-三（4-甲氧基羰基-苯基）咔咯（50毫克）溶于甲醇溶液（20毫升）中，混 合物在乙酸锰四水合物（100毫克）存在下在回流下2小时。将反应混合物冷却，然后用 CH 2Cl 2/ H 2 O （200毫升，1:1）洗涤。有机相收集并用去离子水洗涤两次。将粗产物通过色 谱法纯化（碱性氧化铝，CH 2Cl 2/ CH 3CN=100:5），通过氯仿/己烷结晶后得到绿色产物。 产物产率为91%。UV-Vis (C
10、H 2Cl 2) max : 414,427, 595, 648 nm; MS (MALDI-TOF,negative) m/z:752.023 M ?H?. 锰（III ）的5,10,15-三（4-羧基苯基）咔咯的合成 将上述合成的羧酸酯咔咯金属配合物溶解在100 mL 甲醇/ THF(2 :1)溶液中，加入6 mL 40%的氢氧化钾水溶液,在40下搅拌反应，TLC 检测反应进度，原料点完全消失后停止反应，用5%盐酸酸化后用THF/ DCM/ H 2O(1:1:2)萃取,收集有机相并水洗3次，由Na 2SO 4干燥。减压蒸馏后得到粗产物，以丙酮/正己烷(1:4)重结晶，得到纯净的5,10,1
11、5-三(4-羧基苯基) 咔咯金属配合物，产率为87%。UV-Vis (Tris-HCl buffer I, pH 7.2)max : 402, 432, 656 nm; MS (MALDI-TOF, negative)m/z : 709.981 M ?H?. DNA 氧化裂解实验 紫外可见光谱显示Mn(III) 咔咯配合物在Tris-盐酸缓冲溶液是非常稳定的，并且可以使用3天（图S8） 在缓冲溶液I 中，Mn(III) 咔咯配合物吸收滴定使用3mL 浓度为210?5mol?L ?1 的咔咯溶液，并且加入微升的ct-DNA 溶液。连续加入DNA 溶液并温育5分钟后，记录其吸收值。 荧光光谱测定了
12、溴化乙锭（EB ）-DNA 系统的发光强度。在3mL 含有5mol?L ?1 EB 溶液和30mol?L ?1 DNA 溶液的混合溶液中加入微升的浓缩咔咯配合物溶液，并进行荧光光谱测定。每次加入Mn(III) 咔咯配合物后记录荧光光谱数据。所有样本的激发光谱波长为370nm,发射光谱在500-700nm 处记录。 ct-DNA （1.510?4 mol ?L ?1）的圆二色光谱测定时，在25下，使用氮气流吹扫旋光仪，在1cm 比色皿中，测定不加入以及加入不同浓度Mn(III) 咔咯配合物 (r 0, 0.1, 0.2, 0.5，其中r 是Mn(III) 咔咯配合物与ct-DNA 的摩尔比）的数
13、值。CD 光谱以500nm/min 扫描220600 nm 作为背景，之后所有样品扫描后自动扣除该背景。CD 光谱记录三次扫描的平均值。ct-DNA 的CD 谱的记录作为对照实验。 黏度测定时采用乌氏粘度计，测定时将乌氏粘度计浸没在30.00.1的恒温水浴槽中。加入不同浓度的混合溶液后(r 0, 0.02, 0.04, 0.06,0.08,0.1,其中r 是Mn(III) 咔咯配合物与ct-DNA 的摩尔比），恒温培育5min 后，使用秒表测得ct-DNA 溶液流动的5次时间并求平均值。所得的相对粘度以()3 10/对咔咯与DNA 组成的混合物进行分析，其中和0分别为 加入以及未加入样品时的D
14、NA相对黏度，对照样品在EB溶液中以相同方法处理。 超螺旋pBR322DNA（0.1微克）的裂解反应是在37，体积为10L的缓冲液II中进行的。pBR322DNA（0.1微克）的10微升混合以及，氧化剂和不同浓度的混合物在黑暗培育中30分钟，然后加入2微升缓冲液。得到的反应混合物通过琼脂糖凝胶(1%)电泳进行分析，以70 V为参数电泳2 h后将凝胶放入EB (1 mg/L)中染色，用水冲洗去EB后放入凝胶成像系统中成像并分析。 结果与讨论 DNA结合方式 吸收光谱研究电子吸收光谱是最方便的为确定复合体和DNA之间结合的工具。DNA 碱基对和芳香族发色团之间插入的结合方式通常导致较大的减色效应和
15、红移现象。而外部结合的方式则会引起较小的减色现象和较弱的红移。在ct-DNA存在下的Mn(III) 咔咯配合物的吸收光谱的变化如图1 。在Mn(III) 咔咯配合物溶液中加入ct-DNA导致7.6增色和一个小的红移（从432至435纳米）。这一结果表明Mn(III) 咔咯配合物与DNA的结合强弱为中等，二者应该以外部结合的方式进行作用。 吸 收 率 波长/nm 图1 Mn(III) 咔咯配合物(2.010?5mol?L?1)与ct-DNA相互作用的UV-Vis光谱(pH7.2,5 mmol?L?1 Tris-HCl and 50 mmol?L?1 NaCl缓冲溶液加入ct-DNA溶液浓度(1:
16、 0; 2: 2.010?6; 3:4.010?6;4: 6.010?6; 5: 8.010?6; 6: 1.010?5; 7: 1.210?5;8: 1.410?5 mol?L?1).箭头方向是随着ct-DNA溶液浓度增加吸收度变化 Mn(III) 咔咯配合物与DNA的内在结合常数K b可以根据从增加在432 nm测定的吸光度的变化并使用吸收光谱滴定数据结合下列公式计算： 式中，a是配合物与DNA结合时的摩尔消光系数，f和b分别为配合物未与DNA结合以及 完全与DNA结合的摩尔消光系数。以DNA/ |af|对DNA作图，拟合直线的斜率与截距的比值即为结合常数K b。经计算，Mn(III) 咔
17、咯配合物与DNA的内在结合常数K b为4.67104 L?mol?1 。这一结合常数比锰的阳离子咔咯配合物小，但要大于锰的磺化咔咯配合物。 图2 是DNA/|a-f |与DNA的关系图 荧光光谱研究无论与ct-DNA结合与否，锰咔咯配合物并未在荧光光谱窗口中观察到明显荧光现象，为了研究锰咔咯配合物与ct-DNA的结合，通过改变加入的咔咯配合物的浓度，进而测得EB-DNA系统的荧光发射光谱。单独的EB是一个弱荧光试剂，但当它与DNA 结合后，其发射光谱强度会大大增加。当一些小分子加入EB-DNA系统后，小分子可以取代EB，发光强度降低。EB与Mn(III) 咔咯配合物结合后引起的荧光猝灭示于图4
18、。可以看出，一旦加入Mn(III) 咔咯配合物，发射强度将会减小，这意味着加入Mn(III) 咔咯配合物将会释放EB。 根据经典的Stern-V olmer方程： I分别代表EB-DNA自身荧光强度以及与咔咯结合时的荧光强度，Q代表配合式中，I 0和 物的浓度，以I0/ I对Q作图,线性拟合的斜率即为K SV。由图四可知，Mn III TCPC的K SV 为7.22104L?mol?1。这一结果与电子滴定谱结果相同，这两类实验都证明Mn III TCPC与DNA以外部结合模式结合。 荧 光 强 度 a.u. 波长/nm 图3. EB与ct-DNA结合的发射光谱(pH7.2,5 mmol?L?1
19、 Tris-HCl and 50 mmol?L?1 NaCl缓冲溶液, rMn III TCPC/DNA,EB5.0 mol?L?1, DNA30 mol?L?1, ex370 nm)箭头表示随着Mn III TCPC 浓度增加荧光强度的变化 图四I0/I对咔咯浓度作的线性图 圆二色光谱研究在化合物与DNA结合时，圆二色光谱是一种高效的探究DNA形态改变的方法。ct- DNA一般显示两个峰，由于右旋螺旋性导致在246纳米产生负峰值；由于基堆叠，在272纳米产生正峰值。在DNA与小分子作用时，其圆二色光谱的观测值的改变 通常与DNA结构变化有关：简单的外部沟结合方式和化合物的静电作用对基堆叠（2
20、72nm）和螺旋性（246nm)并没有明显的作用；而内部插入方式会加强两个波段的强度并且稳定ct-DNA右手B的构型。一般说来，还原卟啉与ct-DNA的结合会导致圆二色光谱的减弱，这一特性被用来检验还原卟啉与DNA的结合方式：负ICD带证明是内部插入结合，而正ICD带证明是外部勾结合。而双功能结合模式(又称混合模式)，会产生一个正的ICD峰和一个负的ICD峰。随Mn III TCPC浓度增加，DNA的圆二色光谱结果示于图5。正峰和负峰都证明强度有明显的减弱，并且当Mn III TCPC浓度增加时，最大的峰值出现一个微小的红移。然而，当Mn III TCPC与DNA结合时，无论是正的还是负的IC
21、D带都没有观测到。这些结果强有力的证明了外部结合方式。圆二色光谱同时说明当ct-DNA与Mn III TCPC结合时，其结构并没有明显改变。 CD/mdeg 波长/nm 图5. ct-DNA(1.510?4mol?L?1)的圆二色光谱(pH7.2,5 mmol?L?1 Tris-HCl and 50 mmol?L?1 NaCl缓冲溶液, rMn III TCPC/DNA),箭头表示随着Mn III TCPC浓度增加强度的变化 黏度研究为了进一步说明ct-DNA与Mn III TCPC的结合方式，同时进行了黏度实验，这是在没有结晶以及NMR数据的情况下，最明确也是最重要的方法来确定DNA的结合方
22、式。通常情况下，当化合物以插入DNA时，DNA相邻碱基对的距离会随之变大，导致DNA 双螺旋伸长，使DNA溶液的粘度增大；相反的，当化合物以部分插入模式与DNA 作用时，可能会使DNA的双螺旋发生扭结,，反而会导致DNA溶液黏度减小；而当小分子化合物以静电、沟面结合等非插入方式与DNA 作用时，DNA溶液的黏度无明显变化。当加入 Mn III TCPC后，DNA的黏度并没有明显变化（如图6），这说明Mn III TCPC与DNA以外部方式结合，这与光谱的结论一致。此外，内消旋四（4-羧基苯基）卟啉（TCPP）已被报道与ct-DNA通过外部沟模式结合，其中TCPP内的羧基和DNA碱基对之间氢键起
23、主要作用。结合实验结果以及Mn III TCPC与TCPP结构的相似性，我们推断出Mn III TCPC与ct-DNA 结合方式也是外部沟模型。 图6. ct-DNA溶液与EB溶液（a）和不同浓度的Mn III TCPC（b）作用的相对粘度(pH7.2,5 mmol?L?1 Tris-HCl and 50 mmol?L?1 NaCl缓冲溶液) pBR322 DNA质粒的氧化断裂我们都知道，在过氧化氢存在下，锰的咔咯以及卟啉配合物都能使DNA裂解。本文研究了在不同氧化剂存在下，例如过氧化氢，叔-BuOOH和KHSO5存在时，锰咔咯配合物的核酸酶活性研究。我们使用琼脂糖凝胶电泳研究pBR322DN
24、A质粒的裂解反应。DNA链的断裂发生在一条链还是两条链上会相应形成圆形（形式II）或者直线（形式III）。这两种形式会慢于完整的超螺旋形式（形式I）迁移，而圆形是迁移最慢的。图7显示了在过氧化氢，叔-BuOOH和KHSO5等氧化剂存在时，加入Mn III TCPC后，pBR322 DNA质粒的氧化断裂。只有氧化剂（泳道2-4）和Mn III TCPC（泳道5）存在并未观测到DNA的裂解，当在DNA和过氧化氢或叔-BuOOH混合液中加入咔咯溶液后，从形式I和形式II可以看出DNA的裂解，同时，叔-BuOOH表现出更好的裂解活性（泳道6-7）。然而，加入KHSO5氧化剂后，并未发现DNA 裂解。
25、形式I 形式II 图7加入不同氧化剂MnTCPC (15mol?L?1)对pBR322 DNA (0.1 g) 的裂解结果(pH7.2，50 mmol?L?1 Tris-HCl and 18 mmol?L?1 NaCl 缓冲液) .泳道1, DNA 对照;泳道2, DNAH2O2(20 mol?L?1); Lane 3, DNA叔-BuOOH (20 mmol?L?1); 泳道4, DNA KHSO5 (150mol?L?1); 泳道5, DNA MnTCPC;泳道6, DNAH2O2(20mmol?L?1) MnTCPC; 泳道7, DNA 叔-BuOOH (20mmol?L?1) MnTC
26、PC; 泳道8, DNA KHSO5(150mol?L?1)MnTCPC 图8显示了在过氧化氢存在时，加入不同浓度MnTCPC后pBR322 DNA质粒的氧化断裂情况。结果显示随着MnTCPC浓度增加形式增加（泳道4-8）。当叔BuOOH作氧化剂时也观察到类似结果。有趣的是，在过氧化氢或叔-BuOOH存在时，当Mn III TCPC的浓度达到30微摩尔?L-1时，形式III出现。因此，该羧基锰咔咯在叔-BuOOH或过氧化氢作为氧化剂时可以有效地切割DNA。 形式I 形式 形式 图8 在H2O2 (20 mmol?L?1)存在下,不同浓度MnTCPC对pBR322 DNA (0.1 g) 的氧化
27、裂解(pH7.2，50 mmol?L?1 Tris-HCl and 18 mmol?L?1 NaCl 缓冲液). 泳道1, DNA 对照; 泳道2, DNAH2O2; 泳道3,DNAMnTCPC (30 mol?L?1); 泳道4, DNA H2O2 MnTCPC (5 mol?L?1); 泳道5, DNA H2O2MnTCPC (15mol?L?1); 泳道6, DNAH2O2MnTCPC (30 mol?L?1);泳道7, DNA H2O2 MnTCPC (45 mol?L?1); 泳道8,DNAH2O2MnTCPC (60 mol?L?1). 为了估计观察到的线性化是否表示非随机线性的过
28、程，我们对双链裂解进行了统计学计算。我们根据Poisson分布公式计算在反应切段线性DNA和质粒后单链断裂(n1)和双链断裂(n2)的平均个数。根据FreiMnlder-Trumbo关系，通过随机断裂过程得到1个线型DNA至少需要120个超螺旋DNA，n1/ n2越小表示配合物使DNA发生双链断裂的活性越高。MnTCPC 的n1/ n2值在10-16之间变化（表S1），说明是一个非随机断裂过程。由于Mn III TCPC的羧基与DNA的碱基对之间的氢键作用，在发生一次断裂后配合物分子仍然停留在断裂位置的附近，并催化下一次裂解反应的进行。在这种情况下，Mn III TCPC的活化起了重要作用。为
29、了探究裂解机制，我们使用更多的添加剂进一步实验。加入DMSO（二甲亚砜）、叔丁醇、羟基自由基（?OH）对DNA裂解影响很小。NaN3和L组氨酸会限制DNA裂解，单态氧(1O2)的作用也可以忽略不计。这些结果有力地表明该DNA裂解机制与任何羟基自由基或单线态氧无关。 形式I 形式 图9 在H2O2 (20 mmol?L?1)存在下,MnTCPC(15mol?L?1)对pBR322 DNA (0.1 g) 的氧化裂解(pH7.2,50 mmol?L?1 Tris-HC l and 18 mmol?L?1 NaCl 缓冲液).泳道1, DNA 对照;泳道2, DNAH2O2; 泳道3, DNAMn
30、III TCPC; 泳道4, DNAH2O2Mn III TCPC ; 泳道5, DNAH2O2Mn III TCPCDMSO (500 mol?L?1); 泳道6, DNAH2O2MnTCPC叔-BuOH (500 mol?L?1); 泳道7, DNAH2O2 MnTCPCNaN3(50 mmol?L?1); 泳道8, DNAH2O2MnTCPCL组氨酸(50 mmol?L?1) 在叔-BuOOH存在时，Mn III TCPC对pBR322 DNA裂解会观测到由绿变红的显著地颜色变化。为了研究DNA裂解反应的中间体，在叔-BuOOH存在时，记录了Mn III TCPC的吸收光谱的变化。在Mn
31、 III TCPC溶液加入叔-BuOOH前后可以发现有一明显变化（图10）。叔-BuOOH存在下的Mn III TCPC紫外可见光谱与（氧代）锰（）咔咯相似，这意味着（氧代）锰（）咔咯可能为中间体。然而，过氧化氢存在与否并未发现类似的颜色变化（当该溶液褪色至近无色仅可以发现轻微的红色），当在Mn III TCPC溶液中加入过氧化氢后，吸收强度才变小。两个氧化剂之间的差异可能主要是两方面的原因：第一，它们产生（氧）锰咔咯的能力不同；其次，过氧化氢可与（氧代）锰（）以更快的速度反应，这也表明该反应需要快速消耗（氧代）锰（）咔咯。由Mn III TCPC引起的DNA裂解反应在过氧化氢存在下效率较低可
32、能是由于过氧化氢与DNA竞争相同的中间体（例如（氧代）锰（）引起的。总之，由Mn III TCPC引起的DNA氧化裂解反应主要涉及（氧代）-Mn中间体的形成，其结构类似于锰卟啉。 吸 收 率 波长/nm 图10不同时间下,叔-BuOOH(20 mmol?L?1)存在下,Mn III TCPC (4.0 10?5mol?L?1) 的吸收光谱(pH7.2,50 mmol?L?1 Tris-HCl and 18 mmol?L?1 NaCl 缓冲液) 箭头表示随着时间变化的吸收率 结论 总之，我们合成并表征了一个新的水溶性锰（III）的羧基咔咯化合物（Mn III TCPC）。这种化合物通过外部沟模式与ct- DNA相互作用，并在叔-BuOOH或过氧化氢存在下，可以有效地催化pBR322DNA的质粒氧化裂解，且前一个前氧化剂具有更好的效率。当KHSO 作氧化剂时，并未观察到核酸酶活性。抑制测试表明，羟基自由基或单线态氧在DNA氧5