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1、匡堂堡窒生堂亟兰Q!呈生!旦笠堑鲞笙!翅!坌生旦!笠型：!：堑：盟!：!：!旦坠!型：呈Q!兰骨肉瘤免疫基因治疗研究进展流小舟综述，吴苏稼审校95综 述【摘要】 复发或肺转移的骨肉瘤威胁着患者的生命。由于尚未发现明确的骨肉瘤特异性抗原，因此，将经过修饰的骨肉瘤细胞作为肿瘤疫苗等免疫基因治疗，为骨肉瘤的生物学治疗提供了一种崭新的治疗手段。关键词】 免疫基因治疗；骨肉瘤中图分类号 R738 文献标志码】 A 文章编号】 10088199(2012)01旬095-04Immunogene therapy for osteosarcoma：An updateLIU Xiao-zhou reviewin
2、gWU Su-jia checking(Department of Orthopaedics，Na彬ng General Hospital of Na彬ng Military Command，删，Nanjing 210002，Jiangsu，China)AbstractThe recurrence and lung metastasis of osteosarcoma pose a threat to the life of the patientBecause no definite specific antigens have yet been found against osteosar
3、coma，the immunogene therapy with modified osteosarcoma cells as tumor vaccinesprovides a novel option for the biological treatment of osteosarcomaKey wordsImmunogene therapy；Osteosarcoma0引 言免疫基因治疗是指应用基因转移技术将主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)、共刺激分子、肿瘤抗原以及细胞因子及受体等外源基因导入人体，以提高机体的抗肿瘤免疫反应，从
4、而达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的，是一种新型的肿瘤治疗模式1 o。近几年，针对骨肉瘤及其肺转移的基因治疗研究已在免疫基因治疗、反义基因治疗、抑癌基因治疗、自杀基因靶向治疗等多种基因治疗方面取得了一定进展旧J。免疫基因治疗具备针对性强、有效性高、安全性好的特点，这正是骨肉瘤的基因治疗目前面临的关键问题之一，使得免疫基因治疗成为一种极富前景的治疗方法，近几年这方面研究较多，现综述如下。1免疫基因治疗的原理在肿瘤发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，这可能源于肿瘤细胞作者单位：210002南京，南京军区南京总医院骨科流小舟(医学硕士)、吴苏稼通讯作者：吴苏稼，Email：wusuj
5、iayahooCOBcn本身的免疫源性不强，抗原提呈细胞不能提供足够的共刺激信号，或者机体免疫因子分泌不足及肿瘤细胞诱导机体免疫抑制等。免疫基因治疗正是基于这些环节进行基因干预。干预的方式包括基因转染的转染物、靶细胞和载体。11基因转染的转染物 可分为组织相容性复合体、共刺激分子、肿瘤抗原以及细胞因子4类。组织相容性复合体：在体内MHC分子参与抗原的处理及T、B细胞限制性识别抗原，研究表明，许多人类肿瘤或肿瘤细胞株的MHCI类抗原表达缺失或表达量降低，使Tc细胞不能识别并攻击肿瘤细胞，从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸1。现MHC基因治疗已进入临床实验并表现出了良好的应用前景。共刺激分子：目前已知共刺
6、激分子分为2个家族：B7家族和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族。其中B7家族是惟一能从抗原提呈细胞单向传送信号至T细胞的共刺激分子M o。B7分子在T细胞活化中执行第2信号的功能，骨肉瘤细胞如不表达或仅弱表达该分子，则无法被机体免疫系统识别监视而无限生长。将B7分子导入骨肉瘤细胞可增强或诱发机体抗肿瘤免疫性并增强免疫细胞对骨肉瘤细胞的识别和杀伤能力。肿瘤抗原：万方数据96 医堂受窒生堂撮2Q!生!旦箜堑鲞箜!塑!生生旦!臣堕：!：堑：盟!：!：!坠坠皇型：至Q!兰癌细胞表面存在着的能被机体识别并能被免疫系统破坏的异物，至今为止，在实体肿瘤中已发现500多种
7、肿瘤抗原，如黑色素瘤抗原一1、2和3，T细胞识别黑色素瘤抗原一1、Melan-A、gP 100、癌胚抗原、表皮生长因子受体2、黏液素、前列腺特异抗原等等，其中有些抗原是多种肿瘤共有的，此外，癌基因本身还可作为肿瘤抗原用于基因治疗。细胞因子：目前常用的细胞因子有白细胞介素(interleukin，IL)一2、IL-4、IL一6、IL一12、IL一15、IL18、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和干扰素(interferon，IFN)1等，研究发现细胞因子能激活体内细胞毒性T细胞产生特异性抗肿瘤作用”J。其中IL一2已用于骨肉瘤术后化疗，可诱导自然杀伤细胞和淋巴激活杀伤细胞的产生，
8、但效果有待进一步证实。12基因转染的靶细胞 外源基因可导入肿瘤细胞，也可导入免疫细胞。将细胞因子基因导入肿瘤细胞是以主动性免疫治疗为基础，将细胞因子基因转染入肿瘤细胞中，使肿瘤细胞表面相应的细胞因子受体表达增多，使对肿瘤细胞有直接生长抑制或杀伤作用的细胞因子表达增多，从而大大增强细胞因子的抗肿瘤效果。还可通过抑制肿瘤血管的生成来达到抗肿瘤的目的。将细胞因子直接导入免疫细胞是以过继免疫疗法为基础，将细胞因子基因导入抗肿瘤免疫效应细胞中，使之抗肿瘤作用增强，并以免疫效应细胞为载体细胞，将细胞因子基因携带至体内靶部位，使细胞因子局部浓度提高，从而更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫功能。目前用于肿
9、瘤治疗的免疫效应细胞主要有肿瘤浸润性淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞等，每种效应细胞都有其各自的作用特点。13基因转染的载体如何由载体将免疫基因高效、安全、特异地转染至靶细胞是基因治疗的关键。目前常用的载体有病毒和非病毒载体2种。病毒载体虽转染率高，但受免疫原性、细胞毒性大、携带外源基因大小和病毒滴度不易提高等限制。非病毒载体虽转染率较低，但安全、制备简单，且可携带较大容量的外源性基因，2类载体各有其优缺点，可根据实验需要自主选择。病毒载体包括整合型和非整合型载体，前者主要包括逆转录病毒和腺相关病毒载体；后者主要有腺病毒、单纯疱疹病毒和慢病毒载体等。非病毒载体主要有非
10、生物性聚合物载体转运系统和脂质体转运系统(DNA包裹于或混合于脂质体中)2类。阳离子聚合物载体可与DNA结合形成复合物，其携带片段较大，同时可对其进行修饰，应用前景广阔。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)具有很高的转染率。小分子量的PEI转染率高且毒性小，而大分子PEI转染率高但在体内滞留时间长、毒性大。因此，寻找大小合适的分子以使其转染效率最高而毒性最小是PEI研究的重要方向。Jia等61利用PEI介导见一12基因并通过鼻饲的方法治疗骨肉瘤的肺转移，实验表明PEI是骨肉瘤肺转移基因治疗中传递基因的良好工具。利用PEI-p53复合体气溶胶方法治疗入骨肉瘤小鼠肺转移模型，可有
11、效地减少肺转移灶数目和大小，同时可减少全身毒性。2免疫基因治疗的方式根据免疫基因治疗的原理，目前肿瘤疫苗的制备已成为免疫基因治疗的关键。瘤苗作为肿瘤特异性主动免疫治疗方式，目的是激发启动、调节增强机体固有的免疫功能和抗癌能力以维护机体生理平衡。它具有使机体由被动抗癌向主动抗癌转变的特点。按瘤苗结构和功能的差异，大致可分为：细胞疫苗、多肽疫苗和DNA疫苗。21细胞疫苗细胞疫苗是由体外目的基因导入免疫效应细胞及肿瘤细胞所构成，其主要发展方向是寻找新的靶基因，以期增强肿瘤免疫原性或激活更多的免疫细胞的生长分化。其中，体外诱导肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞作为新的过继性免疫治疗的活性细胞已成为近年来肿瘤治
12、疗研究中的一个新热点，特别是由细胞毒T淋巴细胞筛选肿瘤的特异性抗原作为肿瘤疫苗有广阔的应用前景。已有研究证实树突状细胞是体外扩增特异性抗肿瘤细胞毒T淋巴细胞的最好的抗原提呈细胞。7-8j。另外有研究发现巨噬细胞与淋巴细胞共培养是一种较好的体外扩增特异性细胞毒T淋巴细胞的方法，同时也证明了骨肉瘤的抗原性较强，肿瘤特异性淋巴细胞体外回输的方法具有杀伤性强、特异性高等特点，有望提高骨肉瘤免疫治疗的结果归o。总之，树突状细胞融合细胞瘤苗具有潜在的临床应用价值，如能把这种抗原提呈功能最为强大的抗原提呈细胞和有代表性的人体骨肉瘤细胞系相融合，制备出新型的融合细胞瘤苗，则该瘤苗的应用有望显著提高骨肉瘤患者的
13、存活率0|。近年来，发现一类抗原能激活比普通抗原多达数千倍的T细胞，被称为“超抗原”，主要是一些细菌毒素和逆转录病毒基因产物。有研究表明超抗原与骨肉瘤融合细胞瘤苗共同使用时，可显著降低荷瘤鼠的平均瘤重及肺转移发生率，可显著增强骨肉瘤融合细胞瘤苗所诱导的T细胞增殖和细胞毒T淋巴细胞杀伤活性1I。但超抗原所激活的T细胞可引发人类多种急、慢性疾病，且无抗肿瘤特异性，因此将超抗原用于万方数据匡堂堡窒生堂塑呈Q!至生!旦笠堑鲞箜!翅丝生旦!丝塑：y!：垄：堕!：!：!塑!翌：!Q!兰肿瘤治疗有一定的限制012。22多肽疫苗 多肽疫苗的主要机制是肿瘤细胞能表达独特抗原，从而诱导特异免疫反应。肿瘤抗原的提呈
14、必须经抗原提呈细胞降解为短肽，后与MHC结合，形成肽一MHCT细胞受体复合物提呈在细胞表面，最后被T细胞识别。运用多肽疫苗的目的在于体内把高剂量的肿瘤抗原多肽输送给抗原提呈细胞表面的MHC分子。目前多肽疫苗主要包括肿瘤相关抗原多肽、癌基因及抑癌基因产物、病毒抗原多肽、热休克蛋白等。23 DNA疫苗DNA疫苗是将表达质粒接种于动物，DNA一旦进入细胞，就会通过核膜进入细胞核内，作为外源蛋白长期表达，能诱导长期持续的免疫反应。目前用于构建DNA疫苗的外源基因主要是抗原基因、抗原可变区基因、抗体可变区基因、细胞因子基因和细胞毒T淋巴细胞基因等。DNA疫苗需在辅助性T细胞的参与下才能激发机体的抗肿瘤效
15、应，因此目前多采用融合基因的方法。1。24骨肉瘤免疫基因治疗 复发和肺转移威胁着骨肉瘤患者的生命。由于尚未发现明确的骨肉瘤特异性抗原，因此将经过修饰的骨肉瘤细胞作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的治疗途径值得探讨。Onda等41用荷人骨肉瘤的严重联合免疫缺陷小鼠研究梅毒螺旋体(treponema pallidun，TP)3免疫毒素的抗肿瘤效果，发现TP一3免疫毒素可抑制肿瘤生长。当免疫毒素注入小鼠体内后，肿瘤体积明显减小，且双价TP一3免疫毒素的抗肿瘤效果是单价毒素的2倍。Merchant等015用BALBc、SCID和SCIDbg裸小鼠研究免疫重建对骨肉瘤肺转移的影响，发现将T细胞转入免疫缺陷型裸鼠体
16、内后，肿瘤肺转移的复发率大大降低。Duan等016用SPF级裸小鼠接种人LM7骨肉瘤细胞株，研究发现联合应用儿一12基因治疗和异环磷酰胺化疗可通过FasFasL途径促使肿瘤细胞凋亡，抑制骨肉瘤肺转移。目前研究较多的有细胞因子和B7分子系列基因治疗。IL一12是介导众多免疫机能的重要细胞因子，它能刺激自然杀伤细胞、T细胞分泌IFN一1，同时能调节多种主要细胞黏附分子的功能，故能在针对骨肉瘤的基因治疗研究中广泛应用。Nagano等刊则将携带儿12基因的腺病毒用于小鼠骨肉瘤的基因治疗，发现不仅能抑制原发病灶的增长且对远隔器官的微转移灶同样具有免疫效应。骨肉瘤细胞不表达或低表达B7分子，因而能够逃避机
17、体免疫监视。以B7-1为治疗策略的基因治疗已经在多项实验研究中得到肯定，Nagamori等副将71、B7一a和97所一23基因分别导入骨肉瘤LM8细胞，均表现出明显的抗肿瘤效应，结果还表明B7一la是较B71、B72更为有效的协同刺激分子。此外，尚有许多细胞因子基因，如见一2、L-4、L一5、L一6、L7、儿一18、儿一23、删F、，F以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白介素一1 B转化酶基因等亦被用于转染骨肉瘤细胞株，转染了这些基因的骨肉瘤细胞可以通过所分泌的细胞因子，刺激的T、B淋巴细胞增殖，诱导、增强抗肿瘤效应。另外，目的基因的有效转导和表达是基因治疗成功的前提。因此构建安全、高效、有序调
18、控的载体成为关键。有学者采用PCR方法在抗骨肉瘤ScFv的5端加上引导序列、3端连上人的删F基因，构建成功了分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体基因，并将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLx，从而构建出了抗骨肉瘤单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体pL(ScFvTNF)。25骨肉瘤联合基因治疗研究 多种免疫基因共转染联合治疗骨肉瘤因T细胞的激活存在双信号作用机制，即T细胞的有效激活，除需抑癌基因大肠腺癌息肉病基因提供经加工后形成的MHC抗原肽复合物(第1信号)供T细胞受体识别外，还需提供共刺激信号(第2信号)供T细胞表面相应配体识别。有的免疫基因分子在第2信号识别中起重要作用，能活化细胞杀伤功能导致靶
19、细胞(癌细胞)裂解。因此，各种基因联合协同作用，大大加强了机体抗肿瘤效应，弥补了一种免疫基因治疗肿瘤疗效较弱的缺陷。目前研究最多的是自杀基因与细胞因子的基因联合治疗。Tsuji等1将所一1鼢基因嵌合体转染骨肉瘤细胞，B71、Fas基因都得到表达，并能有效激活体内T淋巴细胞，促进肿瘤细胞凋亡，在抑制骨肉瘤肺转移和提高生存率方面较单一的B71基因更为有效。已有将胛基因分别和粒细胞一巨噬细胸集落刺激因子、L一2、见一7、见一12、儿一18等基因联合应用的报道，均诱发了较强的抗肿瘤作用和免疫应答作用，并强于单独基因免疫效应。胞嘧啶脱氨酶及黑腹果蝇DNA激酶等自杀基因在骨肉瘤的联合治疗中也得以应用。将多
20、药耐药相关蛋白一1和p53ASODN转染入p53高突变的SAOS细胞中，并联合应用多柔比星，加入p53ASODN后可明显抑制MRPl的表达并逆转细胞对多柔比星的耐药性。另外在反义基因与细胞因子的基因联合治疗中，采用反义转化生长因子口1基因技术可以在体内、外阻断骨肉瘤细胞自分泌环，明显抑制骨肉瘤细胞的增殖活性，并对致瘤动物的生存时间产生影响21。Tsang等陋1将反义p53基因转染p53万方数据98 堕望巫究生堂握兰Q!呈生!旦箜箜鲞箜!翅些生旦!塑塑：y!：堑：!：旦!坚皇盟：呈Q 12高突变的SAOS细胞中，发现能抑制MRPl的表达并逆转肿瘤对多柔比星的耐药性。Duan等叫在对成瘤裸鼠运用异
21、环磷酰胺及PE，、儿12基因复合物进行联合治疗中发现能明显下调CD31分子和bFGF的表达，抑制肺转移，从而表明化疗联合基因治疗是一种更具潜力的基因治疗策略。基因治疗的目的是消除肿瘤，基因的联合应用又是基因治疗的必然趋势，它不但可避免单个基因的缺陷，也能提高骨肉瘤治疗效果，但从当前的研究成果来看，基因联合治疗离临床应用还有较大的距离。3结 语综上所述，免疫基因治疗为骨肉瘤的生物学治疗提供了一种崭新的治疗手段，在动物实验和临床试验中显示其具有靶向性和充分激活抗肿瘤免疫等优点。目前，由于理论和技术上还不成熟，疗效尚不理想，仍需在以下几个方面继续研究：联合基因治疗、增强机体的免疫效应、修复因抑癌基因
22、丧失或癌基因过表达而造成的DNA损伤、反义基因治疗、基因靶向、基因载体研究及在基因治疗中对正常组织的保护措施等。目前免疫治疗所使用的大多为肿瘤相关抗原，靶向治疗的有效率并不是很高，因此应该增强疫苗靶向性，以减少对正常组织的损伤。在当前瘤苗的临床应用中，自体瘤苗的成功制备通常会受到疾病本身的困绕，而异体的树突状细胞可从储备的健康志愿者外周血单核细胞获得，又可避免肿瘤患者在接受免疫治疗前都必须提供相当量的自身外周血的缺陷。有研究表明“：通过电融合的方法进行细胞融合制备的异体融合瘤苗有显著的刺激T淋巴细胞增殖和诱导特异性细胞毒性T细胞的潜能，为以树突状细胞为基础的免疫治疗领域提供了新的策略，有望在临
23、床骨肉瘤患者中获得广阔的应用前景。【参考文献】1Parney IF，Chang LJCancer immunogene therapy：a reviewJBiomed Sci，2003，10(1)：3743丁凡，邵增务骨肉瘤基因治疗研究进展J中国矫形外科杂志，2008，16(17)：J326一l 328Williamson NA，Rossjohn J，Purcell AWTumors reveal theirsecrets to cytotoxic T cellsJProc Natl Acad Sci USA，2006103(40)：1464914650周志平，施鑫骨肉瘤预后相关的血管生成因子
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