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1、胃腺癌细胞论文1材料与方法11方法111细胞培养人胃癌细胞SGC-7901细胞株和SGC-7901/DDP培养于PMI-1640培养液(90%)和胎牛血清(10%)、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的混合培养基中，在5%CO2、37的温箱培养。SGC-7901/DDP在无药物培养基连续培育7d，然后将顺铂(终浓度800ng/ml)添加到SGC-7901/DDP的PMI-1640培养基。23d进行一次消化传代，使细胞处于对数生长期。112彗星实验(singlecellgelelectrophoresis，SCGE)取处于对数生长期的SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞，以0.
2、25%胰蛋白酶消化，用PMI-1640培养基制备成浓度为1105个/ml单细胞悬液，台盼蓝染色细胞存活率90%进行SCGE。取110l已熔化的0.5%正常熔点琼脂糖浇注到全磨砂载玻片上，4固化10min后，依次参加10l细胞悬液与75l0.5%低熔点琼脂糖的混合液，4固化10min，固化后的玻片沉浸在细胞裂解液中，4避光裂解1h。PBS清洗载玻片后用碱性电泳液浸没载玻片4避光解旋DNA20min。将电泳仪电压维持25V，电流维持在0.3A，恒压恒流4电泳25min，注意避光操作。然后用中和缓冲液(pH7.4)漂洗，用甲醇固定，滴加30l浓度为20g/ml的EB染液进行染色。400倍荧光显微镜下
3、紫外光激发显像，随机转动视野拍摄30个细胞的SCGE检测图像，实验独立重复3次2。113细胞形态学观察通过倒置显微镜下观察SGC-7901和SGC-7901/DDP形态的不同，拍照记录。114细胞划痕实验取状态良好的人胃腺癌细胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP，胰蛋白酶消化，5106个/ml制备接种到24孔板，5%CO2、37的温箱培养，细胞长成单层后丢弃介质，用灭菌枪头借助无菌尺在每孔的底部中间划一个“十字伤口，用PBS轻轻清洗3遍，洗去悬浮的细胞，每孔参加2ml的无血清的PMI-1640培养基培养，分别于0、12、24h在穿插处拍照，利用Imageproplus软件测量划痕的间
4、距，细胞划痕迁移率(%)=(0h划痕的间距不同时间点的划痕间距)/0h划痕的间距100%，每次实验做3个复孔，实验独立重复3次。115MTT法检测药物的敏感性取状态良好的人胃癌SGC-7901和SGC-7901/DDP，将浓度为7104个/ml的细胞参加到96孔板中，每孔100l体积，过夜培育。当到达80%90%细胞密度，加化疗药物干涉，并设置不同浓度(以上每组3个平行孔)48h，同时设置调零孔和无药物孔。顺铂(0.03、0.3、3、30、60g/ml)、5-氟尿嘧啶(0.1、1、10、100、200g/ml)、依托泊苷(5、10、20、40、80g/ml)、表阿霉素(0.01、0.1、1、1
5、0、100g/ml)、多西紫杉醇(5、10、20、40、80g/ml)、奥沙利铂(5、50、100、200、400g/ml)。在实验孔参加MTT(5mg/ml)20l，37培育4h，注意避光操作。结束培育，将上清液完全吸去，各孔参加DMSO150l，振荡15min，使结晶充分溶解。用酶联免疫吸附法在570nm波长检测各孔光密度值(opticaldensity，OD)，求3孔的平均值，实验独立重复3次。细胞存活率(%)=(实验组OD平均值/对照组的OD平均值)100%，同时计算出各类药物的半数抑制率(halfmaximalinhibitoryconcentrationofasubstance，I
6、C50)，细胞对不同药物的耐药倍数=SGC-7901/DDP对不同化疗药物的IC50/SGC-7901对化疗药物的IC50。12统计学处理采用SPSS190统计软件分析。数据以珋xs表示，单变量两组之间的比拟采用t检验，组间比拟采用单因素方差分析，检验水准=0.05。2结果21人胃腺癌细胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP的DNA损伤修复能力的差异SCGE的结果是利用CASP软件分析尾长作为DNA损伤与修复的评价指标。人胃腺癌细胞SGC-7901和SGC-7901/DDP的彗星尾长分别为29.714.45和20.383.48(t=16.67，P0.05)，见图1、2。22细胞形态人胃
7、腺癌SGC-7901细胞显微镜下观察为单层、形状规则、大小均匀、高折射率、细胞边界、核大、圆形或椭圆形;人胃癌SGC-7901/DDP细胞呈不规则、细胞大小不均一、多核、折光度低，见图3。23细胞划痕实验用显微镜测量人胃腺癌SGC-7901和SGC-7901/DDP在0、12、24h细胞划痕的宽度，结果显示:SGC-7901细胞12、24h划痕宽度比SGC-7901/DDP细胞划痕宽度明显缩小(F=77.12，P0.05)，SGC-7901的迁移能力比SGC-7901/DDP的迁移能力强，见图4、5。24胃腺癌SGC-7901/DDP对各类化疗药的敏感性人胃腺癌细胞SGC-7901和SGC-7
8、901/DDP对不同药物的敏感性，顺铂、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、依托泊苷、多西紫杉醇对顺铂耐药株及其亲本细胞SGC-7901的IC50和耐药倍数见表1，SGC-7901/DDP对顺铂耐药的同时对表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷、奥沙利铂也具有不同程度的耐药。3讨论目前已有大量的实验致力于对顺铂耐药性的研究，其中DNA的损伤修复作用引起广泛关注，核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair，NE)是DNA修复的重要途径，核苷酸切除修复穿插互补基因1(excisionrepaircross-complementinggene1，E-CC1)蛋白是顺铂诱导NE中的关键酶，
9、ECC1是能够识别DNA损伤和断开链间交联的功能，研究表明，ECC1mNA和蛋白的过表达使DNA修复能力的加强与临床胃癌患者顺铂化疗疗效呈负相关性。然而，目前对NE能力的检测多用于临床胃癌组织，无法反映肿瘤的生物学行为发生变化所导致的NE的变化，有学者提出外周血淋巴系统与肿瘤细胞携带有同源基因，均具有一样的NE系统。本研究以人胃腺癌SGC-7901及其顺铂耐药株SGC-7901/DDP作为研究对象，用SCGE的方法检测在人胃腺癌SGC-7901细胞株和其顺铂耐药株SGC-7901/DDP的DNA修复能力，结果显示人胃腺癌SGC-7901/DDP较其亲本细胞的DNA修复能力强;此结果表明肿瘤细胞
10、的DNA的修复能力与对顺铂的敏感性呈负相关，与临床研究结果一致。同时本研究在表明人胃腺癌SGC-7901顺铂耐药后其DNA修复能力加强的基础上，用MTT的方法检测SGC-7901顺铂耐药株对其他化疗药物的敏感性能否发生变化，结果显示SGC-7901/DDP对顺铂耐药的同时对表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷等也具有不同程度的耐药，可能由于表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、多西紫杉醇均通过与DNA作用而发挥细胞毒性，由于胃癌顺铂耐药细胞株的DNA修复能力加强，一定程度抑制其发挥细胞毒性作用，并且有研究表明，肿瘤细胞内顺铂积累的减少，是肿瘤细胞产生耐药的重要原因，多药耐药基因1是编码P糖蛋白和多药耐药相关蛋白(multi-drugresist-ance-associatedprotein，MP)的基因，P糖蛋白是一种跨膜蛋白，其通过ATP供能，将药物泵出细胞;MP也是一种能量依靠的运输蛋白，其主要是识别与谷胱甘肽构成MP-1-ATP，自动把药物从细胞内转移到细胞外，进而让细胞内药物浓度降低，药物抵制肿瘤的影响削弱甚至消失，使细胞获得耐药性。本研究通过细胞划痕实验显示SGC-7901/DDP的迁移能力较正常的胃癌细胞株SGC-7901减弱，可能是顺铂进入细胞后构成稳定的Pt-DNA加合物，并且顺铂与金属硫蛋白的稳定结合使细胞黏附稳定、不易软化、较正常细胞株不易转移。