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1、子宫内膜癌细胞论文1材料和方法11材料来源111Westernblot法检测用蛋白裂解缓冲液提取蛋白，取上清用ELISA试剂盒(德国，Pierce)检测总蛋白浓度。取70g的总蛋白于10%SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜，5%的脱脂奶封闭，分别加兔抗人Matriptase(11000)、兔抗人HAI-1(110000)，使用鼠源性-actin单克隆抗体(11000)作为内参照，4孵育过夜，HP标记的二抗孵育，ECL化学发光剂显色，于暗室中显影定影。X片用Tan-non图像分析系统照相，采用TanonGis软件40自动分析软件进行积分光密度分析，以Matripase(HAI-1)/-act
2、in积分光密度比值表示相对蛋白含量。112NA干扰构建3条由慢病毒载体表达的Matriptase基因siNA(Ma-siNA-89851、-siNA-89881和-siNA-89873)，其中Ma-siNA-89873对Matriptase抑制水平最显著。实验前1天，HEC-1A和L952细胞接种在6孔板，密度约(35)104/ml，配制1108TU/ml病毒。根据预染结果，每孔加病毒量20l，总体积1ml，转染72h后，荧光显微镜下观察细胞内GFP表达情况，同时以正常培养基为空白对照组(Control，Con)慢病毒载体NO53为阴性对照组(Negativecontrol，NC)。荧光定量P
3、C和Westernblot法检测siNA干扰后Matriptase表达情况。113细胞划痕实验用ImageJ软件测量各个时间点的划痕两侧的细胞间距离(m)变化，以0h划痕边沿的距离减去24h迁移边沿的距离来计算细胞的迁移距离，反映细胞的迁移能4。11.4穿膜小室实验Transwell小室直径上取5个视野，照相，计数每个视野穿过膜的细胞数，取其平均值，结果以x珋s表示。以穿膜细胞数反映肿瘤细胞的侵袭能力5。12统计学处理采用SPSS190统计软件。上述实验均重复3次，实验数据以x珋s表示，计量资料进行单因素方差分析，双变量相关分析采用Person分析。P005为差异有统计学意义。2结果21荧光定
4、量PC和Westernblot检测Matriptase、HAI1mNA及蛋白表达情况HEC-1A、HEC-1B、L952细胞中，MatriptasemNA相对表达量分别为(021230021)、(0000695000012)和(017780013)，组间比拟差异有统计学意义(F=122629，P0001);HAI-1mNA相对表达量分别为(028270049)、(000263000043)和(024200032)，组间比拟差异有统计学意义(F=32875，P001)。Matriptase和HAI-1蛋白在HEC-1A和L952中均呈阳性表达，但两者在HEC-1B中均未表达或低于可测水准，与mN
5、A水平相吻合。HEC-1A、L952和HEC-1B细胞中Matriptase/HAI-1mNA比值分别为075、073和002;HEC-1A和L952细胞比拟差异无统计学意义(P005)(图1)。22转染siNA后HEC-1A和L952细胞中Matriptase、HAI-1mNA和蛋白表达HEC-1A和L952细胞中，空白组(Con)和阴性对照(NC)组中Matriptase和HAI-1的表达水平比拟，差异均无统计学意义(P005)。与阴性对照组(NC)比拟，转染siNA-89873后两株细胞的MatriptasemNA表达水平均显著下调(HEC-1A:0215700124vs00358001
6、11，P0001;L952:0184900053vs0034100017，P0001)，抑制率分别到达834%和815%;但两株细胞的HAI-1mNA表达水平无显著差异(P005)。Matriptase和HAI-1蛋白水平改变情况与mNA水平相一致(图2、3)。转染Matriptase的靶向siNA后，子宫内膜癌HEC-1A细胞的Matriptase/HAI-1的比值降为011，而L-952细胞则降为012。23NA干扰后HEC-1A和L952侵袭迁移能力的改变小分子NA干扰Matriptase表达后两株细胞的迁移能力和侵袭能力变弱。Person相关性分析显示，MatriptasemNA表达水
7、平与肿瘤细胞迁移距离和穿膜细胞数均呈正相关(迁移=097，侵袭=0982;P均001)。3讨论肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的病理经过，包括降解ECM进而促进肿瘤细胞的分离、种植和远处扩散。目前以为，基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶在该经过中扮演了重要的角色。Matriptase是TTSPs家族成员之一，与肿瘤的增殖、进展和转移密切相关。据统计，全球女性肿瘤发病率中，子宫内膜癌占第四位，仅次于乳腺癌、肺癌和大肠癌，居全球女性生殖道肿瘤的第一位。迄今为止，子宫内膜癌中Matriptase/HAI-1相关性的研究仅有2篇，Matriptase/HAI-1在子宫内膜癌发生发展中所扮演的角色尚未可知。Naka
8、mura等初次提出，Matriptase可能与子宫内膜癌的预后不良相关，Matriptase高表达与侵及子宫肌层深度(P=0004)、宫颈浸润(P=0021)、淋逢迎转移(P=0009)及腹水细胞学(P=0045)等侵袭转移生物学行为密切相关。HAI-1作为ECM降解系统的另一重要角色，在子宫内膜癌标本中表达水平明显低于正常内膜标本;增加HAI-1基因的表达水平可有效抑制内膜癌细胞的增殖和侵袭迁移能力，且伴随着Matriptase表达水平的下调。由此有学者提出，维持Matriptase/HAI-1的平衡状态在肿瘤的进展经过中至关重要。据报道，Matriptase/HAI-1比值的失衡包括上升或
9、下降都可能具有促进肿瘤的发生发展。在胰腺癌细胞中发现HAI-1表达水平下降，伴随Matriptase表达水平升高，HAI-1表达的缺失和Matfiptase/HAI-1比值降低促进肿瘤细胞的侵袭生物学特征。同样在前列腺癌中亦发现，Matfiptase/HAI-1比值随着前列腺癌恶性程度的递增而升高。而Matriptase/HAI-1比值在进展期结直肠癌中表现为下降，在浸润性乳腺癌中比值下降而在侵袭性乳腺癌中比值明显上升。本研究在Matriptase和HAI-1阳性表达的子宫内膜腺癌L952细胞和HEC-1A细胞中Matriptase和HAI-1表达水平及Matriptase/HAI-1比值，差
10、异无统计学意义(P005)，侵袭迁移能力亦无差异;而HEC-1B细胞呈Matriptase和HAI-1极低水平，mNA和蛋白均显示为阴性表达。在Matriptase-HAI-1系统阳性的HEC-1A和L952细胞中，采用siNA特异性下调Matriptase表达，HAI-1基因表达未见变化，但Matriptase/HAI-1比值由敲除前约077降低到敲除后011，而细胞的侵袭迁移能力显著下降。统计学分析显示，Matriptase表达水平、Matriptase/HAI-1比值与子宫内膜癌细胞侵袭迁移能力呈正相关。HEC-1B细胞为高侵袭能力细胞株，而其Matriptase和HAI-1系统呈阴性表
11、达，猜测与细胞的遗传背景不同相关(如雌激素受体表达水平)，且肿瘤的侵袭和转移经过复杂，所涉及信号通路繁多，如抗凝血酶、蛋白酶活化受体2(protein-aseactivatedreceptor-2，PA-2)、前列腺蛋白酶原、miNA等。此外亦有文献报道，Matriptase表达水安然平静Matriptase/HAI-1比值在进展至侵袭阶段时呈降低趋势，后期可通过增加Matriptase表达水平进一步探究Matriptase在子宫内膜癌侵袭迁移经过中扮演的角色。综上，Matriptase表达与子宫内膜癌细胞侵袭迁移能力呈正相关。但为了但全面完善评估Matriptase在子宫内膜癌侵袭转移经过中的角色，动物体内荷瘤实验必不可少。总之，Matriptase与子宫内膜癌的侵袭转移经过密切相关，可能成为判定肿瘤预后的新指标及辅助治疗的新靶标。