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1、微生物检测的定义n在特定的环境下（无菌），采用适当的方法对样品中目标微生物进行增殖和培养，并对经放大后的目标微生物进行感官、生理、生化等方面的特性分析和判定，以确定样品中目标微生物的量和/或质的特性的过程。培养基n液体、半固体或固体形式的，含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖或保持其活力的物质培养基类型n各别成分培养基各别成分培养基 Culture medium prepared from individual components n实验室用不同的化学和/或生物试剂按照一定的配方、比例配置而成的培养基n即用型培养基即用型培养基 ready-to-use medium n以即用形式置于容器中(
2、 例如：平皿、试管或其它容器) 供应的培养基。n脱水合成培养基脱水合成培养基 culture medium prepared from commercially dehydrated formulation. n不立即使用的干粉形式的(如：粉末、小颗粒、冻干等形式)培养基。标准的主要内容n购置验收要求(CNAS-CL01 ：4.6.2)n生产企业提供资料n实验室外观检查记录n储存、使用、弃置要求（CL11：5.9)n成品的质量控制(概述第2部分.重点为菌株)n物理指标:培养基外观n微生物指标:重点提到对测试菌株的要求nSN/T1538.1n常规质量控制要求n物理指标:外观控制n微生物指标:污染
3、;生长率;选择性;特异性(CNAS-CL01 : 4.6.2; CNAS/CL11：5.9)n性能测试方法举例n对质量控制要求的补充说明和详细实例nSN/T1538.2购置验收要求n生产企业提供材料：n产品标签：n产品名称、编号n批号n使用前的pHn必要的安全/危害数据 n有效期n技术数据清单n质控证书n性能评价n所用测试菌株n实验室验收：n产品标签：n名称和批号n有效期n接收日期n包装及其完整性nSN/T1538.1-2005中4.1;对应CNAS/CL01 4.6.2内容,通常要记录(采购服务和供给)储存要求n例行常规检查内容:n容器密闭性复查n首次开封日期n内容物的感官检查 n使用前检查
4、(即用型培养基):n颜色是否发生变化?n是否蒸发/脱水?n是否有微生物生长 ?n注:SN/T1538.1:2005中4.2;对应CNAS/CL01:4.6.2内容,可不做记录实验室自制和使用要求n培养基用水n称量和复水n溶解和分装npH测定n灭菌n监测n琼脂培养基融化n培养基脱气n添加成分制备和加入n平板的制备和储存n培养n注:SN/T1538.1-2005中4.3-4.4内容,对应CNAS/CL11:5.9部分内容,红色部分通常需做记录培养基的弃置要求n所有污染和未使用的培养基的弃置必需采用安全的方式，并且要符合相关法律法规的规定。n注:SN/T1538.1-2005中4.5内容,应符合CN
5、AS/CL01:5.3.5(废弃物处理程序)要求质量控制基本要求n对培养基的要求n分装数量n外观、色泽和均一性n琼脂凝胶的硬度n水份含量npH n缓冲能力n微生物污染(即用培养基)n对基础成分的要求n对不稳定的生物成分，使用时可根据情况调整用量。注:SN/T1538.2中对制造商的要求微生物学要求n微生物污染n生长特性n生长率n选择性n生理生化特性n选择性和特异性n抗菌实验特性 红色部分为对培养基进行质量控制的主要内容生长率(定量测试方法)nPR = NS/NOnNS ：待测培养基平板上得到的菌落总数。nN0 ：参考培养基平板上获得的菌落总数，应100cfu 要求：非选择性培养基上目标菌的生长
6、率最低应为0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1 选择性(定量测试方法)nSF = DO DSnD0：能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度nDS：能在测试培养基上显示生长的最高稀释度 n非目标菌在选择性培养基上的SF至少为2 n半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制 培养基测试方法n定量测试方法n半定量测试方法n定性测试方法几种方法的使用原则n通常使用半定量或定性测试方法就能满足实验室对培养基性能测试的要求n评价新的培养基或新的供应商的产品时，应采用定量测试方法n采用定量方法时，必须使用参考培养基进行对照；采用半定量和定性方法时，使用参考
7、有助于结果解释。n参考培养基必须是从近期批次中选出的已知质量良好的培养基。介绍几种常用的质控方法nMiles-Misra法(定量方法)n改进的平板划线法(半定量方法)n平板接种观察法(定性方法)n上述均为固体培养基测试方法,液体培养基定量和半定量测试方法也要通过固体培养基菌落计数技术才能得到结果。改良Miles-Misra法操作方法n测试菌株过夜培养物10倍稀释n测试平板和参照平板划分为4个区域并标记n从最高稀释度开始 ，分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域n将稀释液涂满整个1/4区域，37C培养18 hr。n对易计数的区域计数，按公式计算结果方法举例测试培养基在10-5稀释度上有
8、30个菌落参照培养基在10-5稀释度上有40个菌落通过公式计算： PR = 10-5 30/ 10-5 40=0.75注：在几种固体计数方法中，Miles-misra方法和螺旋平板涂布法效果较好。改进的划线法接种法模式图计 算n计算生长指数G ：n每条有菌落生长的划线记作1分，每个n仅一半的线有菌落生长记作0.5分n没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则记作0n如：菌落在A区和B区全部生长，而在C区有一半线生长则G 为10 n目标菌在培养基上应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制 n目标菌的生长指标G大于6时，培养基可接受结果解释定性测试方法 n用3mm接种环取测试菌培养物，在测
9、试培养基表面划平行直线。可同时在一个平板上接种多个菌株，但划线不能交叉n按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养 结果解释n培养后按以下方法计分：n0表示无生长n1表示微弱生长n2表示生长良好n目标菌得分应为2，并有典型的菌落外观、大小和形态n非目标菌的生长应部分或全部被抑制 质控菌株要求n标准菌株：来自国际/国家菌种保藏中心(本标准要求为ATCC菌株)或经ISO9002认证的经销商提供的菌株(有资质)n制备储备菌株和工作菌株时一次制备多份，每株菌原则上不能重复使用n通常工作菌株不能再传代，但处理得当可再次使用标准储备菌株(Reference stock)n标准菌株在实验室经过一次传
10、代获得的一组完全相同的菌株n传代菌株应当完全具备标准菌株的所有性状n传代时要保证一定的量(减少传代次数)n每株菌株尽量避免多次使用n采用不同的保存方法保存期限不同n如冻干法,液氮法,穿刺法,液体石蜡法,斜面保存法等(见后)菌种保藏方法n液氮保存法n低温保存法n液体石蜡保存法液氮保存法液氮保存法保存制备细胞悬液，甘油或二甲亚砜作保护剂分装无菌安瓿瓶，每管0.2ml预冻至-40（控制温度下降速率为1min）放入液氮生物贮存罐中气相保存恢复直接浸入38水浴中解冻510min转接于适宜培养基内培养注意：大多数属种适于慢速冻结和快速解冻适用菌种适用菌种病毒支原体各类细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌蓝藻动物
11、细胞 液体石蜡覆盖保存法n传代保存的变相方法n能够适当地延长保存时间n优质石蜡121高压灭菌2小时，160干燥箱中灭菌12小时，放冷备用n液体石蜡的深度以1cm左右 n保存期通常6个月至一年适用菌种n霉菌、酵母菌、放线菌、部分细菌。如：大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌等需氧性细菌n不能用于低温冷冻保存的微生物（如孢子形成能力极差的丝状菌）n不适于用菌种：固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、沙门氏菌，丝状菌中的毛霉、根霉菌等甘油低温保藏法n保藏方法：保藏方法：菌种悬浮在10(体积分数)甘油蒸馏水中。置于低温(-70)保藏。n注意事项：注意事项：所要保藏的菌种，最好先培养至对数期；使用液体培养基时，可直接加到已灭过菌的甘油中，并使甘油的终浓度在l030左右。为避免反复冻溶，可分装于小离心管中，置低温保藏。n适用菌种：适用菌种：基因工程、丝状真菌、酵母、细菌和放线菌方法举例nSN/T1538.1-2005nSN/T1538.2-2007谢谢大家n李卫华n山西出入境检验检疫局技术中心n太原市漪汾街8号n邮编030024nEmail:n电话(传真):0351-6162536n手机:1360351065141 结束语结束语