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1、第一节第一节 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育p微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求p发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的分离和选育p发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的分离和选育p微生物菌种的分离微生物菌种的分离p微生物菌种的选育微生物菌种的选育微生物菌种的分离微生物菌种的分离p施加选择性压力分离法施加选择性压力分离法p随机分离方法随机分离方法施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法富集培养富集培养 供给特殊培养基或加入某些抑制剂。供给特殊培养基或加
2、入某些抑制剂。培养方法培养方法分批式富集培养分批式富集培养, ,连续富集培养连续富集培养固体培养基固体培养基p分批式富集培养（摇瓶培养）分批式富集培养（摇瓶培养）重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可将优势微生物分离出来。将优势微生物分离出来。 移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。 施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法p连续富集培养：连续富集培养： 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。 改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。改变限制性基质
3、浓度可以控制两种菌的比生长速率。 连续富集培养法可以筛选出能连续富集培养法可以筛选出能共共生的稳定混合培养物生的稳定混合培养物，例如用甲，例如用甲烷作碳源筛选到甲烷营养型和一烷作碳源筛选到甲烷营养型和一些非甲烷营养型的共生菌。些非甲烷营养型的共生菌。施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法固体培养基的使用固体培养基的使用 常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所需的基常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所需的基质，以便促使酶产生菌的生长。质，以便促使酶产生菌的生长。 举例：举例：产产碱性蛋白酶碱性蛋白酶的菌的分离。碱性土壤铺在的菌的分离。碱性土壤铺在pH9pH91010的琼脂培养基的琼脂
4、培养基( (含有均匀的不溶性蛋白质含有均匀的不溶性蛋白质) )表面。表面。根据根据蛋白质水解圈的大小蛋白质水解圈的大小判断蛋白酶的产生能力。判断蛋白酶的产生能力。 施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法 有些微生物的产物对筛选没有任何选择性优势。因此有些微生物的产物对筛选没有任何选择性优势。因此常需随机地分离。常需随机地分离。 随机分离方法随机分离方法筛选！筛选！生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选 核苷酸等生长因子的生产不能作为分离步骤中的选择核苷酸等生长因子的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过筛选试验检出产压力，可用随机办法分离产生菌，并通过筛选试验
5、检出产生菌。生菌。 例如：例如：通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，便可检出生长因子产生菌。便可检出生长因子产生菌。随机分离方法随机分离方法-筛选筛选抗生素产生菌筛选抗生素产生菌筛选在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基中，检测抗菌活性。中，检测抗菌活性。随机分离方法随机分离方法-筛选筛选药理活性化合物的筛选药理活性化合物的筛选 酶靶法：酶靶法： 基本原理：基本原理：一种化合物如在体外具有抑制代谢过程的一种化合物如在体外具有抑制代谢过程的某一关键酶的作用，它在体内一般也具有相应的药理作用某
6、一关键酶的作用，它在体内一般也具有相应的药理作用。 若将体外筛选出的活性化合物，再用动物做实验，可若将体外筛选出的活性化合物，再用动物做实验，可筛选出新的药理活性化合物。筛选出新的药理活性化合物。 随机分离方法随机分离方法-筛选筛选随机分离方法随机分离方法-筛选筛选多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。 可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。随机分离方法随机分离方法-筛选筛选生物进化过程中野生型微生物形成完善的代谢调节机制 不会有代谢产物的积累 解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物积累微生物
7、育种的目的方法：突变、体内重组方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）体外重组（基因工程）微生物菌种的选育微生物菌种的选育 经典育种经典育种：自然选育自然选育和和诱变育种诱变育种 定向育种定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢调控和基因工程等。调控和基因工程等。微生物菌种的选育微生物菌种的选育自然选育自然选育：利用菌种自然突变：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)(Spontaneous Mutation)进进行菌种筛选的过程。行菌种筛选的过程。自然突变自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。：微生物在没有人工参与下
8、所发生的突变。引起自然突变两个原因：引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应多因素低剂量的诱变效应和和互变互变异构异构效应。效应。自然选育自然选育 多因素低剂量诱变效应多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原：自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质质( (如如H H2 2OO2 2) )的作用等。的作用等。自然突
9、变自然突变 互变异构效应互变异构效应：五种碱基五种碱基第六位上的酮基和氨基，第六位上的酮基和氨基， G G 和和T T可以酮式或烯醇式出现，可以酮式或烯醇式出现， A A 和和C C可以氨基或亚氨基形可以氨基或亚氨基形式出现。式出现。自然突变自然突变NNNHNNH2腺嘌呤腺嘌呤(adenine, A)NN HN HNN H2O鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine, G)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine, C)NN HN H2O尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U)NHNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T)N HN HOOCH3嘌呤嘌呤(purine) NNNHN123456789NNNHNNH2腺
10、嘌呤腺嘌呤(adenine, A)NNHNHNNH2O鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine, G)NNH132456嘧啶嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine, C)NNHNH2O尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U)NHNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T)NHNHOOCH3 五种碱基都能形成酮式五种碱基都能形成酮式- -烯醇式或氨基烯醇式或氨基- -亚氨基的互变亚氨基的互变异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。 HNHNCNH2+O+HNNH2NNH2亚亚氨氨基基氨氨基基+ H+NCOHNCO-+ H+酮酮式式
11、烯烯醇醇式式互变异构效应互变异构效应互变异构效应互变异构效应p平衡倾向于酮式和氨基时，平衡倾向于酮式和氨基时，DNADNA双链中以双链中以ATAT和和GCGC碱碱基对为主。基对为主。p T T以烯醇式出现，在以烯醇式出现，在DNADNA复制到达该点的一瞬间，与复制到达该点的一瞬间，与G G配对；配对；pC C以亚氨基出现时，在新合成的以亚氨基出现时，在新合成的DNADNA单链的单链的C C点出现点出现A Ap碱基对发生自然突变几率约碱基对发生自然突变几率约1010-8-81010-9-9。结果：结果：1 1、菌种衰退和生产质量下降；、菌种衰退和生产质量下降；2 2、对生产有益的突变。、对生产有
12、益的突变。 为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种( (复壮复壮) )。 实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落，实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落，从中选从中选 出出稳定菌株稳定菌株用于生产。用于生产。自然突变自然突变自然选育自然选育p自然选育的优越性自然选育的优越性: :简单易行简单易行, ,可以达到纯化菌可以达到纯化菌种种, ,防止菌种衰退防止菌种衰退, ,稳定生产稳定生产, ,提高产量的目的提高产量的目的. .p缺点缺点: :效率低效率低, ,进展慢进展慢, ,很难使生产水平大幅度提很难使生产水平大幅度提高高. .自然选育程序：自然选育程序： 把菌种制
13、备成单孢子悬液，适当稀释，在平板上分把菌种制备成单孢子悬液，适当稀释，在平板上分离，挑取单菌落进行生产能力测定，经反复筛选，以确离，挑取单菌落进行生产能力测定，经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株。定生产能力更高的菌株。自然选育自然选育 诱变育种理论基础：诱变育种理论基础：基因突变基因突变。 诱变育种诱变育种 自然突变：自然突变：自然条件下出现的基因突变。自然条件下出现的基因突变。 诱发突变诱发突变：用各种物理和生物因素、化学：用各种物理和生物因素、化学因素人工诱发的基因突变。因素人工诱发的基因突变。诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提高高获得特性优
14、良变异菌株的几率高。获得特性优良变异菌株的几率高。诱变育种诱变育种主要步骤主要步骤出发菌株的诱变处理出发菌株的诱变处理 和和 突变体的筛选突变体的筛选。 出发菌株诱变处理出发菌株诱变处理 包括：包括：出发菌株的选择出发菌株的选择诱变剂的选择诱变剂的选择诱变剂量和处理时间的确定诱变剂量和处理时间的确定 （1 1）出发菌株出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。几个应注意的问题几个应注意的问题（2 2）复合诱变因素的使用）复合诱变因素的使用 野生型菌株野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；用单一诱变因素有时能取得好效果；老老菌种
15、菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。 青霉菌选育青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变，：先以氮芥处理很短时间而不引起突变，再用再用UVUV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可获得高产菌株。获得高产菌株。几个应注意的问题几个应注意的问题 乙烯亚胺和乙烯亚胺和UVUV复合处理，氯化锂和复合处理，氯化锂和UVUV复合处理，都复合处理，都用得较普遍，且有一定成效。用得较普遍，且有一定成效。 氯化锂氯化锂本身无诱变作用，与一些
16、诱变因子一起使用时本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时能促进突变。能促进突变。几个应注意的问题几个应注意的问题（3 3）剂量选择）剂量选择 变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一定关系。定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据用致死率作为选择适宜剂量的依据。 合适剂量合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。：同时增加变异幅度与正突变。几个应注意的问题几个应注意的问题 绝大部分个体死亡绝大部分个体死亡少数存活少数存活 多数未变多数未变 少数突变少数突变 多数负变多数负变 少数正变少数正变 多数幅度小多数幅度小 少数幅度大少数幅度大 多数不宜投产多数
17、不宜投产 少数适宜投产少数适宜投产存活率存活率 突变率突变率 正变率正变率 高产率高产率 投产率投产率 （4 4）变异菌株的筛选）变异菌株的筛选 诱变目的诱变目的：高产菌株、新产物。：高产菌株、新产物。几个应注意的问题几个应注意的问题突变体的筛选突变体的筛选 一般经初筛和复筛一般经初筛和复筛初筛初筛：一般：一般定性定性，更多的是通过，更多的是通过平板平板采用变色圈、透明圈、采用变色圈、透明圈、 抑制圈、生长圈或沉淀圈等方法测定抑制圈、生长圈或沉淀圈等方法测定某变异特性的某变异特性的 存在存在，粗略推算出产量，有时也用液体培养。，粗略推算出产量，有时也用液体培养。复筛：复筛：对初筛结果的菌株生产
18、性能作比较精确的对初筛结果的菌株生产性能作比较精确的定量定量测定测定 还需通过小型和中型发酵投产试验才能用于生产还需通过小型和中型发酵投产试验才能用于生产1231 123初筛初筛HC0 =HC1+ HC2 + HC3)HC0 =HC1+ HC2 + HC3)HC1 HC0能力增强能力增强)HC2 HC0能力减弱能力减弱)HC3= HC0能力不变能力不变)1 1233HC0 =HC1+ HC2 + HC3)HC0 =HC1+ HC2 + HC3)HC1 HC0能力增强能力增强)HC2 HC0能力减弱能力减弱)HC3= HC0能力不变能力不变)1233 诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过
19、程诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态，中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态，必须进行自然分离必须进行自然分离诱变育种和杂交育种必须环节。诱变育种和杂交育种必须环节。 自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株。第一轮：第一轮：一个出发菌株一个出发菌株选出选出200个菌株个菌株选出选出50株株选出选出5株株诱变处理初筛（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：第二轮：5个出发菌株个出发菌株 选出选出50株株 选出选出5株株40株株40株株40株株40株株40株株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每
20、瓶四株）饱浸含某种指示饱浸含某种指示剂的固体培养基剂的固体培养基的滤纸片变色圈的滤纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液喷上稀碘液 固体培养基中渗入溶解性固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。质形成透明圈。利用一些有特别营养要利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物物的
21、前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕能力，工具菌就能围绕该菌生长该菌生长 待筛选的菌株能待筛选的菌株能分泌产生某些能分泌产生某些能抑制工具菌生长抑制工具菌生长的物质的物质 营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型抗阻遏和抗反馈突变型 特殊变异菌的筛选方法特殊变异菌的筛选方法组成型突变株组成型突变株抗（敏感）性突变株抗（敏感）性突变株高丝氨酸缺陷菌生产高丝氨酸缺陷菌生产赖氨酸赖氨酸必需氨基酸必需氨基酸食品、医药、畜牧业需要量很大食品、医药、畜牧业需要量很大但在但在代谢过程代谢过程中，一方面赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制，中，一方面赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制，另一方面还同时生成
22、苏氨酸和甲硫氨酸，使赖氨酸不能在细另一方面还同时生成苏氨酸和甲硫氨酸，使赖氨酸不能在细胞内累积胞内累积高丝氨酸缺陷菌高丝氨酸缺陷菌（不能合成高丝氨酸脱氢酶，补充适量高丝（不能合成高丝氨酸脱氢酶，补充适量高丝氨酸）则合成大量赖氨酸氨酸）则合成大量赖氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸 磷酸磷酸天冬氨酸天冬氨酸 半醛半醛高丝氨酸高丝氨酸 苏氨酸苏氨酸 甲硫甲硫氨酸氨酸 赖氨酸赖氨酸AKHSDHC.glutamicum的代谢调节与赖氨酸生产的代谢调节与赖氨酸生产为反馈抑制为反馈抑制为阻遏为阻遏AK：天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶 HSDH：高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶 营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选 p
23、淘汰野生型淘汰野生型 p检出缺陷型检出缺陷型 p鉴定缺陷型鉴定缺陷型 淘汰野生型淘汰野生型 原因：原因： 营养缺陷型的比率很低，只有百分营养缺陷型的比率很低，只有百分 之几到千分之几，淘汰为数众多的之几到千分之几，淘汰为数众多的 野生型菌株，可达到野生型菌株，可达到“浓缩浓缩” ” 营养营养缺缺 陷型的目的陷型的目的 方法：方法：抗生素法抗生素法或或菌丝过滤法菌丝过滤法抗生素法抗生素法 原理：原理：抗生素只杀死生长中的细菌或真菌，抗生素只杀死生长中的细菌或真菌，在基本培在基本培养基上加抗生素养基上加抗生素，将野生型细菌杀死，营养缺陷型不，将野生型细菌杀死，营养缺陷型不死，从而来浓缩营养缺陷型死
24、，从而来浓缩营养缺陷型细菌细菌 通常通常 青霉素青霉素 （抑制细胞壁的合成）（抑制细胞壁的合成）真菌真菌 制霉菌素制霉菌素 （破坏真菌细胞膜）（破坏真菌细胞膜） 菌丝过滤法菌丝过滤法 原理：原理：在在基本培养基基本培养基上野生型发育成菌丝而营养缺陷上野生型发育成菌丝而营养缺陷 型不能，培养一段时间后，用擦镜纸等合适滤型不能，培养一段时间后，用擦镜纸等合适滤 纸过滤，重复多次过滤除去大部分野生型个体。纸过滤，重复多次过滤除去大部分野生型个体。 条件：条件：丝状真菌和放线菌丝状真菌和放线菌检出缺陷型检出缺陷型 pA A夹层培养法夹层培养法 pB B逐个检出法逐个检出法 pC C影印培养法影印培养法
25、 夹层培养法夹层培养法 方法：方法：先倒一薄层不含菌先倒一薄层不含菌MMMM，冷凝后加上一层混有经过，冷凝后加上一层混有经过诱变处理的菌液的诱变处理的菌液的MMMM，再浇一，再浇一薄层薄层不含菌不含菌MMMM，“三明三明治治”，培养长出菌即野生型，在皿底做上记号，再倒第四，培养长出菌即野生型，在皿底做上记号，再倒第四层层CMCM培养，野生型继续繁殖，菌落变大，营养缺陷型开培养，野生型继续繁殖，菌落变大，营养缺陷型开始生长，菌落较小始生长，菌落较小 CMMM培养皿侧面培养皿侧面培养皿正面（新、小菌落培养皿正面（新、小菌落即营养缺陷型）即营养缺陷型）逐个检出法逐个检出法 依次挑取菌落依次接种在依次
26、挑取菌落依次接种在MMMM和和CMCM培养比较，在完全培养基培养比较，在完全培养基的某一部位长出菌落而的某一部位长出菌落而MMMM不长，则是营养缺陷型不长，则是营养缺陷型 CM MMCM营养缺陷型营养缺陷型影印培养法影印培养法完全培养基完全培养基影印接种影印接种基本培养基基本培养基营养缺陷型营养缺陷型营养缺陷型营养缺陷型影印培养法影印培养法鉴定缺陷型鉴定缺陷型 生长谱法生长谱法 生长谱法生长谱法 方法：方法： 营养缺陷型菌株与营养缺陷型菌株与MMMM以一定的浓度混合倒在以一定的浓度混合倒在培养皿上，干燥后，在皿底培养皿上，干燥后，在皿底画上若干区域，然后，在正画上若干区域，然后，在正面加上微量
27、的氨基酸、维生面加上微量的氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等营养物的素、嘌呤或嘧啶等营养物的粉末或结晶（滤纸片法也粉末或结晶（滤纸片法也可）。可）。培养后，如果某一营养物的培养后，如果某一营养物的周围有微生物的生长圈，说周围有微生物的生长圈，说明它就是微生物的营养缺陷明它就是微生物的营养缺陷型。型。诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）夹层培养法夹层培养法逐个检出法逐个检出法影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法反馈抑制和反馈阻遏反馈抑制
28、和反馈阻遏阻遏蛋白阻遏蛋白操纵基因操纵基因抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株p结构基因突变，使结构酶无结合能力但结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；有催化活性；末端产物的积累末端产物的积累p调节基因或操纵基因突变调节基因或操纵基因突变p产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合，但不发生作用；合，但不发生作用；末端产物的积累末端产物的积累抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选方法方法：末端产物结构类似物筛选；末端产物结构类似物筛选；未突变者死，未突变者死，突变为抗者生并产菌落突变为抗者生并产菌落营养缺陷型回复
29、突变株筛选。营养缺陷型回复突变株筛选。活性复，结构改变活性复，结构改变目标产物结构类似物赖氨酸S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸-(AEC)苏氨酸-氨基-羟基戊酸（AHV)异亮氨酸乙硫氨酸精氨酸D-精氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸组成酶和诱导酶组成酶和诱导酶组成酶组成酶 微生物有些酶总是适量地存在微生物有些酶总是适量地存在, ,它们是不依赖它们是不依赖 于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶酶, ,如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。诱导酶诱导酶 适应性酶适应性酶, ,是依赖于某种底物或底物的结构类是依赖于某种底物或底物的结
30、构类似物的存在而合成的酶。似物的存在而合成的酶。i i基因基因P POOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A有乳糖时有乳糖时调节蛋白亚基调节蛋白亚基 调节蛋白调节蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白RNARNA聚合酶聚合酶i i基因基因P POOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A诱导物乳糖诱导物乳糖无活性的无活性的阻遏蛋白阻遏蛋白转录转录翻译翻译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷通透酶半乳糖苷通透酶-半乳糖苷乙酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶mRNAmRNA没有乳糖时没有乳糖时诱导酶弊端诱导酶弊端诱导酶的生产需要诱导物，而诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、
31、数量以且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。诱导物有及分解产物的影响。诱导物有时又比较昂贵。时又比较昂贵。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少会引起酶合成的减少. .生产成本提高生产成本提高 组成型突变株组成型突变株p突变发生在调节基因或操纵基因突变发生在调节基因或操纵基因, ,解除对诱导物解除对诱导物的依赖的依赖, ,可获组成型突变株。可获组成型突变株。p少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株超产突变株。i i基因基因P POOLac Z
32、Lac ZLac YLac Ylac Alac A有乳糖时有乳糖时调节蛋白亚基调节蛋白亚基 调节蛋白调节蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白RNARNA聚合酶聚合酶i i基因基因P POOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A诱导物乳糖诱导物乳糖无活性的无活性的阻遏蛋白阻遏蛋白转录转录翻译翻译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷通透酶半乳糖苷通透酶-半乳糖苷乙酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶mRNAmRNA没有乳糖时没有乳糖时p筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。过菌落分辨。加诱导酶合成抑制物加诱导酶合成抑制物交替培养法交替培养法显色反应法显
33、色反应法组成型突变株筛选组成型突变株筛选组成型突变株筛选组成型突变株筛选加诱导酶合成抑制物加诱导酶合成抑制物 如：加邻硝基如：加邻硝基-D-D-岩藻糖苷，抑制岩藻糖苷，抑制-半乳糖苷半乳糖苷酶合成。酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。用乳糖，生长，被富集。 组成型突变株筛选组成型突变株筛选交替培养法交替培养法 含诱导物（乳糖）中培养含诱导物（乳糖）中培养组成型组成型快快不含诱导物（葡萄糖）中培养不含诱导物（葡萄糖）中培养诱导型失酶诱导型失酶反复。反复。组成型突变株筛选组成型突变株筛选显色反应法显色反应法 不含诱导物
34、平板培养不含诱导物平板培养加底物加底物分分解（有颜色变化）解（有颜色变化）检出。检出。如如: :邻邻- -硝基苯酚半乳糖苷硝基苯酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)可被可被-半乳糖半乳糖苷酶水解为半乳糖和黄色的邻苷酶水解为半乳糖和黄色的邻- -硝基苯酚硝基苯酚（ONPONP）抗（敏感）性突变株筛选抗（敏感）性突变株筛选p包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：提高产量；抗生素抗性突变：提高产量； 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；抗噬菌体突变：消除噬菌体污染； 条件抗性突变：如温度，可提高产量；条件抗性突变：如温度，可提高产量；（温度敏感突变，高温呈
35、营养缺陷表型）（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型） 抗（敏感）性突变株筛选抗（敏感）性突变株筛选敏感突变：敏感突变：如：柠檬酸如：柠檬酸-异柠檬酸异柠檬酸氟乙酸抑制顺乌头酸酶氟乙酸抑制顺乌头酸酶氟乙酸敏感突变型氟乙酸敏感突变型顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。少，柠檬酸积累。 顺乌头酸酶顺乌头酸酶抗性突变菌株的筛选抗性突变菌株的筛选 抗生素抗性突变株抗生素抗性突变株 在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。性突变可提高抗生素产量。 抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，抗
36、生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。还能提高其它代谢产物的量。 条件抗性突变条件抗性突变 因环境不同，能表现为因环境不同，能表现为 野生型野生型 菌株的特性和突变型菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。 温度敏感突变常用于温度敏感突变常用于提高代谢产物产量提高代谢产物产量 致死致死营养缺陷营养缺陷抗性突变菌株的筛选方法抗性突变菌株的筛选方法 一次性筛选法一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株
37、。一次性筛选出少量抗性变异株。 噬菌体抗性菌株噬菌体抗性菌株 耐高温菌株耐高温菌株 阶梯性筛选法阶梯性筛选法 梯度平板法梯度平板法 纸片扩散法纸片扩散法 用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般了菌悬液的平板上，一般9 9厘米的培养皿中等距放置三片厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。可能就是抗性菌。组成酶变异株
38、的筛选组成酶变异株的筛选诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少，诱导物有时又会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。比较昂贵。生产成本提高生产成本提高 控制酶合成的调节基因发生了变异 诱导酶转变成组成型酶 具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法 恒化器法：恒化器常被用于微生物的“驯化”，添加不能起诱导作用的低浓度底物，缓慢生长 循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。 诱导抑制剂法：加入诱导抑制剂如-硝基苯基-岩藻糖苷阻止某些诱导酶的合成 .抗（敏感）性突变株筛选p包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：提高产量； 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；（与噬菌体存在与否无关） 条件抗性突变：如温度，可提高产量；（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型） 物敏突变：如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。