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1、2.1 发酵工业微生物菌种2.1.1概述菌种是微生物工程的核心；选育、保藏、复壮 2.1.2 发酵工业常用微生物种类细菌 主要生产氨基酸、核酸、酶、多糖、有机酸等常用菌种：Escherichia coli;Bacillus subtilis;Lactobacillus lactis;Corynebacterium glutamicum放线菌主要生产抗生素、某些特定的酶；常用菌种：Streptomyces lividans;S.coelicolor;S.hygroscopicus;Micromonospora echinospora;Actinoplanes ferrugineus;酵母主要生产
2、酒精、有机酸、单细胞蛋白常用菌种：Saccaromyces cerevisiaePichia pastorisCandida glabrataC.tropicalsPhaffia rhodozymaYarrowia lipolitica霉菌主要生产：抗生素、有机酸、酶、色素；Penicillium chrysogenumAspergillus nigerA.oryzaeRhizopus oryzae2.1.3 发酵工业微生物的基本要求遗传稳定遗传稳定易于产生繁殖体易于产生繁殖体必须是纯种或明确的少数几种菌组成的简单混菌系统，不必须是纯种或明确的少数几种菌组成的简单混菌系统，不应带有杂菌及噬菌体
3、；应带有杂菌及噬菌体；种子的生长必须旺盛、迅速；种子的生长必须旺盛、迅速；产生所需产物的时间短；产生所需产物的时间短；容易分离提纯；容易分离提纯；有自身保护机制，抵抗杂菌和噬菌体污染的能力强；有自身保护机制，抵抗杂菌和噬菌体污染的能力强；能保持较长的良好经济性能；能保持较长的良好经济性能；菌株对诱变剂处理比较敏感，可能选育出高产的菌株；菌株对诱变剂处理比较敏感，可能选育出高产的菌株；菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素2.1.4菌种的制备原理和方法菌株获得的主要方法：向菌种保藏机构索取；从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：从
4、保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：经济性经济性 指导性指导性 从自然界分离筛选；从某些发酵制品中分离；从自然界筛选目标菌株的方法与步骤含微生物样品的采集（含微生物样品的富集培养）微生物的分离野生型目的菌株的筛选鉴定微生物的分离稀释涂布法划线法；生化反应法；t 高温下培养：高温下培养：分离嗜热细菌；分离嗜热细菌；t 培养基中不含培养基中不含N：分离固氮菌；分离固氮菌；t 培养基加抗生素培养基加抗生素：分离抗性菌；分离抗性菌；组织分离法合理的筛选策略是关键！氨基酸产生菌的筛选氨基酸产生菌的筛选 样品样品 分离分离 初筛（除真菌）初筛（除真菌）在分离平板上生长获得多个单菌落在分离平板上生长获得
5、多个单菌落 复印平板（复印平板（copy 法）法）平板培养，其中有产生氨基酸平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到对应到copy前相应前相应 u.v线杀死长好的菌落线杀死长好的菌落 位置，找到目的菌落位置，找到目的菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈产氨基酸菌落周围有生长圈 目的菌落进行液体培养，目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定对产物进行定量测定筛选产物含量高的菌株筛选产物含量高的菌株对产物进行菌种筛选时，有两条经验对产物进行菌种筛选时，有两条经验：进化上向上兼容；进化上向上兼容；次
6、生代谢在进化上后移，芽孢菌以上更次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上更有筛选意义有筛选意义http:/ ；从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株工业目的的优良菌株 ；从已知菌种和大自然中分离新菌株从已知菌种和大自然中分离新菌株寻找新的发酵产品的产生菌；寻找新的发酵产品的产生菌；寻找老产品的新的优良菌株。寻找老产品的新的优良菌株。http:/ 适应性进化（菌株驯化）Adaptive evolution 通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法；（柠檬酸）2.1.6 菌种的保藏保藏、退化、复壮菌种的退化和防止 菌种
7、退化：菌株由于移接传代或保藏之后，群体中某些生理特征或形态特征逐渐减退或完全丧失的现象，主要表现为生长速度变慢和目标产物生产能力的下降；防止退化的方法：尽量减少传代；经常进行纯化；创造良好的培养条件；单核细胞的移植传代；采用有效的保藏方法；菌种的复壮在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找到尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有性状的措施；方法：纯种分离（单细胞分离）；淘汰法；寄生体内复壮法；工业微生物菌种的保藏 不死、不变、不乱；斜面保藏法4；非长期保存；1-3个月需传代，可传3-4代；液体石蜡油保藏法；尤其适用于丝状担子菌；一般存活期为57年，有的可以达
8、到10年以上，但以23年转管冷冻干燥保藏法；5-10年，不适合丝状真菌；液氮超低温保藏法；-196；甘油低温保存：15%甘油，-80；2.2 微生物诱变育种2.2.1 诱变育种目的提高目的物产量；改善菌种特性、提高产物质量；简化工艺条件；开发新品种；2.2.2 诱变育种基本步骤 出发菌株original strain的选择:具备一定生产能力或某种有利性状；纯种；已发生过其他突变；对诱变剂敏感的增变变异株；出发菌株的纯化单细胞悬液的制备；诱变剂及诱变剂量的选择 诱变处理方式（单因子、复合因子）诱变菌株的筛选高通量筛选技术：2.3 微生物原生质体育种和基因组改组育种2.3.1 原生质体的特征对外界
9、变化更敏感；对诱变剂更敏感；对某些噬菌体失去敏感；2.3.2 微生物原生质体再生育种出发菌株的选择菌体的活化原生质体的制备原生质体再生菌株的分离筛选原生质体的制备：酶解法预处理：细菌（青霉素）；放线菌（甘氨酸）；霉菌（脂肪酶）；酵母菌（EDTA或巯基乙醇）置于稳定剂中；酶的选择：放线菌、细菌（溶菌酶）霉菌（蜗牛酶或纤维素酶）酵母（蜗牛酶或葡聚糖酶）原生质体再生（细胞壁）双层平板上，半固体培养基中；2.3.3 微生物原生质体诱变育种原生质体技术诱变育种技术出发菌株的选择菌体的活化原生质体的制备诱变育种原生质体再生菌株的分离筛选2.3.4 微生物原生质体转化技术整条染色体DNA、片段DNA或者质粒
10、DNA转化原生质体获得转化子的育种技术；出发菌株的选择菌体的活化原生质体的制备转化原生质体再生菌株的分离筛选2.3.5 微生物原生质体融合技术用物理、化学或生物学的方法处理两亲株原生质体，促使其融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，通过筛选而得到集二者优良性状于一体的稳定融合子；出发菌株的选择（具有较大遗传差异的近亲菌株）菌体的活化原生质体的制备原生质体融合原生质体再生菌株的分离筛选原生质体融合两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定剂中，在促融剂的诱导作用下，接触融合成异核体，经核融合成杂合二倍体，再经染色体交换产生重组体，称融合子；物理方法：电融合、激光融合化学方法：PEG（1000-6000分子量）2.3.6 基因组该组育种在微生物全基因组改造中快速进行特定群体的基因交换重组，从而增加群体遗传多样性，改良群体中个体性能等的连续遗传改变及表型选择过程；人工诱变+原生质体融合2.4 微生物的基因工程育种2.4.1 基因工程育种是指重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（细胞），实现遗传物质的重新组合，并使得目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术；主要步骤：目标DNA的获得 目的基因与载体的重组 将重组基因转入宿主细胞 重组子的筛选