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1、学习必备欢迎下载第一章生物药物概论1、生物药物的分类： （1）基因重组多肽、蛋白类治疗剂（2）基因药物（ 3）天然生物药物（4）合成与部分合成的药物。 DNA 重组药物和基因药物的区别：DNA重组药物即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等；基因药物即以基因物质（DNA或 RNA ）为基础，研究而成的基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。2、生物药物的作用特点：药理学特性：（1）药理活性高（2）治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠。 （3）毒副作用较少，营养价值高。（4）生理副作用常用发生。理化特性：（1
2、）生物材料中的有效物质含量低，杂质种类多且含量相对较高。（2）生物活性物质组成结构复杂、稳定性差。 （3）生物材料易染菌，腐败。 （4）生物药物制剂的特殊要求。3DNA 重组药物有：（1）细胞因子干扰素类：- 干扰素、 - 干扰素、 - 干扰素（ 2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子：白介素-2 （IL-2 ）和突变型白介素-2 （Ser125-IL-2）肿瘤坏死因子类主要有TNF-和TNF-受体。 （3）造血系统生长因子类：粒细胞集落刺激因子（G-CSF ） 、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF ） 、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF ） 、促红细胞生成素（EPO ） 、促血小板生成素（
3、TPO ） 干细胞生长因子（SCF ） （4）生长因子类： 胰岛素样生长因子 （IGF） 、表皮生长因子 （EGF ） 、血小板衍生生长因子（PDFD ） 、转化生长因子（ TGF- 和 TGF- ） 、神经生长因子及各种神经营养因子。（5）重组多肽与蛋白质类激素：重组人胰岛素（ rhInsulin） 、重组人生长激素（rhGH） 、促卵胞激素（ FSH ） 、促黄体生成素（LH）和绒毛膜促性腺激素（ HCG ） 、重组人白蛋白和重组人血红蛋白（6）心血管病治疗剂与酶制剂：因子、水蛭素、tpA、rtpA 、尿激酶、链激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖脑苷酶及DNsae等（ 7）重组
4、疫苗与单抗制品：重组乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗和肿瘤疫苗。4 术语药物：用于预防、诊断、治疗保健的一类物质。药品：是指用于预防、治疗、诊断人体疾病，有目的地调节人体生理功能并规定有适应证或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药材、中药饮片、中成药、化学原料药及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。药品根据其来源可分两大类：天然药物即植物药、动物药和矿物药；合成药包括化学合成药与微生物合成药。天然药物一般来源于自然界，很少有人工加工过程，药物成分相对较复杂。生化药物：（ biopharmaceutics）是利用生物体、生物组
5、织、细胞或其成分，综合应用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。DNA重组药物：即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等。基因药物：以基因物质（RNA和 DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酸等。生化药物：是运用生物化学的理论、方法、技术与研究成果，从生物体（包括动物、植物、微生物和海洋生物）分离、纯化得到的一些重要生理活性物质，经药效学和毒理学研究证明对
6、于疾病的防治是安全有效的一大类药物，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、维生素、激素、糖类、脂类、核酸、核苷酸及其衍生物。反义药物：是以人工合成的10几十个反义寡核苷酸序列与模板DNA或 mRNA 互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和mRNA 的翻译， 从而起到抗肿瘤和抗病毒作用，目前有 20 多种反义药物进入临床试验，其中 ISIS 是 FDA批准的第一个反义药物，用于治疗AIDS病患者的巨噬细胞病毒性视网膜炎。核酸疫苗：将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA 或 RNA ）直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答以达到防病治病的目的
7、。名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 1 页，共 18 页 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载第二章生物制药工艺学技术基础1、生物活性物质的浓缩与干燥的方法：生物活性物质的浓缩： （1）盐析浓缩 （2）有机溶剂沉淀浓缩（3）用葡聚糖凝胶 （Sephadex）浓缩 （4）用聚乙二醇（ PEG ）浓缩（5）超滤浓缩（6）真空减压浓缩与薄膜浓缩生物活性物质的干燥： （1）减压干燥（2）喷雾干燥（3）冷冻干燥2 简述生物活性物质分离纯化的主要原
8、理：根据混合物中的不同组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，或者将混合物置于某一相中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达到分离的目的。主要纯化原理有： （1）根据分子的形状和大小不同进行分离（ 2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离（3）根据分子极性大小及溶解度的不同进行分离。（4）根据物质吸附性质的不同进行分离（5）根据配体特意性进行分离3、保存菌种、菌种退化、检查菌种退化常用的菌种保存方法：斜面低温保藏法、液体石蜡封藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法、甘油冷冻保藏法、其他如沙土管保藏法。菌种的退化意味着随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减
9、退或消失，最终导致营养细胞的死亡。一般把菌株的生活力、产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化。检查菌种退化： （1）单位容积中发酵液的活性物质含量（2）琼脂平皿上的单菌落形态，（3）不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征，如形成孢子的能力；（4）发酵过程的pH 变动情况（5）发酵液的气味、色泽4 重组 DNA技术基本原理，如何获取目的基因基因工程是通过体外重组将甲生物体的基因转入乙受体生物体内进行表达的生物技术。获取目的基因的方法有： （1）鸟枪克隆法（2）人工合成目的基因 1 、酶促方法 2 、化学合成法5 常见的基因载体有，如何构建基因重组体在体外将含目的基因的DNA片段和具有自
10、我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接，获的重组 DNA分子。常见的基因载体有：链霉菌质粒、芽孢杆菌载体、质粒、噬菌体（phage） 、黏粒 (cosmid) 、病毒载体等。6 DNA重组体有主要有哪几种表达系统？各有什么特点？基因工程包括转录、翻译及翻译后加工等过程。根据宿主细胞种类不同，分为原核基因工程和真核基因工程。原核基因工程以原核细胞作为表达宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌等；而真核基因工程则以真核细胞为表达宿主，如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。（1）大肠杆菌表达系统：遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便，繁殖力强（2030min 即可繁殖一代），便于大规模培养，
11、成本较低，表达水平较高（可达总蛋白的5%6% ） ，下游技术成熟、易于控制。目前使用最广泛、最成功的表达系统。（2）酵母表达系统：是真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后的修饰与糖基化；表达量高，如明胶表达量达14。8g/L; 培养成本低；适用高密度发酵；杂蛋白少，产物易纯化。（3）哺乳动物表达系统：中国仓鼠卵巢细胞（CHO ）和猴肾细胞（COS ）优点是能识别和剪切外源基因的内含子并加工成为成熟的 m RNA.但其培养技术难度大，成本高，研究与生产周期长。三体系表达特点比较表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危险大肠杆菌多肽、蛋白质 或 融 合蛋白质菌体内容易部 分 可 获 得
12、高产一般对原核者好真核者稍差不大名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 2 页，共 18 页 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载酵母多肽、蛋白质 或 糖 基化蛋白菌 体 内 或分 泌 出 细胞容易可高产菌体内， 稍复杂真 核 的 接 近 天然不大哺乳动物细胞完 整 糖 基化蛋白质分 泌 出 细胞较难成本高可高产简单几 乎 可 为 天 然产物需 注 意 有致癌因素7 生物制药工艺中试放大的目的，如何进行中试放大。中试放大是由小试转入工业化生产
13、的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模化生产至关重要。这些研究工作都是围绕着如何提高收率，改进操作，提高质量，形成批量生产等方面进行。中试放大的方法有经验放大法，相似放大法和数学模型放大法。主要采用经验放大法。8 术语微生物纯培养：系指只在单一种类存在的状态下所进行的生物培养。所有微生物、植物和动物都可以进行这种培养，高等植物或动物的无菌培养（无菌饲养）也可说是一种纯培养。纯培养最重要的是在于微生物的生理研究，方法是依靠灭菌和分离，是由巴斯德（LPasteur ）和柯赫（ RKoch）建立起来的。在自然界中，有的培养条件很困难，特别是具有密切共生关系的生物及进行寄生性营养的生物；也有一
14、些在理论上不可能进行纯粹培养的生物。诱变育种：是指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。诱变育种主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株3 个部分。蛋白质工程：在基因水平上设计表达新功能蛋白。转基因动物：将外源基因导入哺乳动物的受精卵或胚胎中，使导入基因与受精卵染色体整合，并将外源基因稳定地子代，使子代表现外源基因的性状。蛋白质组学：研究细胞、组织或个体全部蛋白质的全部表达状态与功能状态，是后基因时代重要研究方向第三章、生物材料的预处理1、去处发酵液中的杂蛋白的方法：（1）加入凝聚剂（2）加入絮凝剂
15、（3）变性沉淀（4）吸附（5）等电点沉淀（ 6）加各种沉淀剂2、去处发酵液中的钙、镁、铁离子的方法：（1）离子交换法去铁离子（ 2）沉淀法钙与草酸钠或草酸镁的去处用草酸沉淀不完全，碱性条件下用磷酸盐，或三聚磷酸钠，生成络合物（污染河水）3、影响絮凝效果的主要因素：絮凝剂分子量、絮凝剂用量、pH及操作条件絮凝剂分子量越大，链越长，吸附桥架效果就越明显，但分子链越大，絮凝剂在水中的溶解度降低；絮凝剂浓度越低， 增加用量有助于架桥，提高絮凝效果， 但过多引起吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层，使胶粒稳定，降低絮凝效果； pH的变化影响离子型絮凝剂功能团的电离度，电离度的提高使电排斥作用增强，架桥能力最佳
16、；搅拌应注意， 刚开始搅拌迅速使絮凝剂分散，发挥絮凝作用， 絮凝团形成后， 高的剪切力会打碎絮凝团。4 细胞破碎：方法原理特点机 械法匀浆法基于液相的剪切力适用面广，处理量大， 速度快，工业广泛使用，不适用某些高度分支微生物，产热大， 可能会生物活性物质失活珠磨法研磨作用破碎适用面广，处理量大， 工业广泛使用，产热大，可能会生物活性物质失活超声波超声波的空穴作用破碎产热大，散热不易，成本高，适用小量样品破碎物 理法干燥法菌体细胞膜渗透性变化，自溶较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 -
17、 - - - - - - - - - - - - - - 第 3 页，共 18 页 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载冻融法胞内冰晶引起细胞膨胀破碎较温和， 但破碎作用较弱， 常需反复冻融， 实验室使用渗 透 压 冲 击法渗透压突然变化， 细胞快速膨胀变化较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用化 学法化 学 试 剂 处理化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞成分需选择合适的试剂， 减少对活性物质的破坏，可应用于大规模生产制成丙酮粉丙酮迅速脱水， 破坏蛋白质与脂质结合的键迅速脱水，减少蛋白质变性，促进某些结合酶释放生 物法酶解法用酶反应分解破坏细胞壁上特有的化学键反应条件温和， 但成本较
18、高， 一般仅适用于小规模应用组织自溶法利用组织中酶改变、 破坏细胞结构、使组织自溶反应条件温和、 成本低， 不适用于易受酶降解的目的物的提取5、超声波破碎细胞的原理：超声波的破碎作用与液体中空穴的形成有关。当超声波在液体中传播时，液体中的某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。由于拉力的作用，出现细小的空穴。这种空穴泡在超声波的继续作用下，又迅速闭合，产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的黏滞性旋涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使其内部液体发生流动，而使细胞破碎。术语：1、 凝聚作用：（coagulation）是指在某些电解质的作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥作用降低，破坏了胶体系统的
19、分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。2、 絮凝作用：（flocculation）是指在胶体悬浮液中加入絮凝剂后，胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀的过程。3、 渗透压冲击法：把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压的作用，细胞外的水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂，使产物释放到溶液中。4、 错流过滤：滤液给过滤介质表面一个平行的大流量冲刷，则过滤截止表面积累的滤饼就会减少到可以忽略的程度，而通
20、过过滤介质的流速却比较小。第四章萃取法1、溶液萃取法的基本原理：如某一抗生素在有机溶剂（不溶于水）中溶解度较大，当料液与有机溶剂接触后，抗生素就从水相转移到有机相中。另外，抗生素在不同pH 条件下，可以有不同的化学状态（如游离态酸、碱或成盐），其分配系数亦有差别，若适度改变pH ，可将抗生素自有机相再转入水相，这样反复萃取，可以达到浓缩和提纯的目的。 2 、溶液萃取法按操作方式不同，可分为单级萃取和多级萃取，后者分为错流萃取和逆流萃取。当萃取剂用量相同时，二级萃取收率比单级萃取收率高，在萃取用量一定的情况下，萃取次数愈多，则萃取愈完全。多级逆流与错流萃取相比，萃取剂耗量较少，萃取液平均浓度较高
21、。3、乳化剂能使乳化液稳定： （1） 、界面膜形成表面活性剂分子聚集在界面上，形成紧密吸附层，在分散相表面形成保护层。（2） 、界面电荷的影响：O/W型乳状液油滴多数是带负电的，W/O型乳状液中水滴则带正电。产生排斥力。（3） 、介质黏度：乳化剂能增加乳状液的黏度，增加保护膜的机械强度，则形成的界面膜不易被破坏，并可阻止液珠的聚结。4、破坏乳化剂的方法：（1） 、加入表面活性剂（2）离心（3）加电解质（4）加热（5）吸附法破乳（6）高压电破乳（7）名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - -
22、 - - - - - - 第 4 页，共 18 页 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载稀释法（8）其他途径：超滤、反应萃取、中性磷萃取、脂肪类萃取剂5、影响乳化剂类型的因素有：（1）乳化和破乳化（2）pH 的影响（3）温度和萃取时间的影响（4）盐析作用的影响（5）溶剂种类、用量及萃取方式的选择6、影响双水相萃取的因素：（1）成相高聚物的分子量（2）成相高聚物浓度界面张力（3）电化学分配盐类的影响（4）疏水效应（ 5）温度及其他因素7、影响超临界流体萃取的因素：（1）压力的影响（2）温度的影响（3）助溶剂（4）物料性质的影响8 术语双水相萃取：不同的高分子溶液相互混合可产生两相
23、或多相系统，利用物质在互不相溶的两水相分配系数的差异来进行萃取的方法。双节线：高聚物P、Q的浓度均以重量百分含量表示，相图右上部为两相区，右下部为均相区，两相与均相的分界线叫双节线多级错流萃取：料液经萃取后的萃余液再用新鲜萃取剂进行萃取的方法。多级逆流萃取： 在第一级中加入料液 （F） ，萃余液顺序作为后一级的料液，而在最后一级加入萃取剂（S） ，萃取液顺序作为前一级的萃取剂。由于料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为逆流萃取。反胶束萃取： 表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，在有机溶剂内形成聚集体，其中表面活性剂的非极性基团在外，与非极性的溶剂接触，而极性基团在外，
24、形成极性核，从而能够溶解极性物质，进行萃取。超临界流体萃取： （supercritical fluid SCF）是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能力来进行分离纯化的技术。第五章沉淀和结晶1、盐析沉淀是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。基本原理：一、盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互结合。二、中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水
25、区域，疏水区相互作用，使其沉淀。2、影响盐析效果的因素： （1）无机盐的种类（2）溶质（蛋白质） 种类的影响（3）蛋白质浓度的影响（4）温度的影响（5）pH的影响3、影响沉淀效果的因素： （1）有机溶剂种类及用量（2）pH的影响（3）温度（4）无机盐的含量（5）某些金属离子的助沉淀作用（6）样品浓度4、形成过饱和溶液的方法： （1）蒸发法（2）温度诱导法（3）盐析结晶法（4）透析结晶法（5）有机溶剂结晶法（6）等电点法（7）微量扩散法（8）化学反应结晶法（9）共沸蒸馏结晶5、影响晶体大小的因素： （1）过饱和度：增加过饱和度能使成核速度和晶体生长速度加快，对前者影响较大，过饱和度增加，晶体较细
26、小。（2）温度快速冷却，达到较高的过饱和度，晶体细小形成针状晶；反之，缓慢冷却得到较粗大的晶体。（3）搅拌速度：搅拌能促进成核和加快扩散，提高晶核长大的速度，过快则晶体会被打碎。经验表明，搅拌速度愈快，晶体愈细。（4）晶种加入晶种能诱导结晶，还能控制晶体的形状、大小和均匀度。6、等电点沉淀的特点，如何应用对于两性物质，等电点时净电荷为零，使稳定的双电层及水化膜变弱或破坏，分子间排斥电位降低，吸引力增大，相互聚集，产生沉淀。等电点沉淀法操作简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物质少，常用的纯化方法，主要适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质。应用：胰岛素纯化时，在pH8。0 除去碱性杂蛋白
27、，调pH3。0 除去酸性杂蛋白，粗提液经此处理后纯度大大提高，有利于后步提取操作。7 术语 Ks 盐析：在一定的pH 和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析。名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 5 页，共 18 页 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载盐析：在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析。盐析分布曲线：蛋白质沉淀的速度可用dS/dP 对盐饱和度（ P）作图表示。蛋白质沉淀的速率开始时十分迅速，以后变慢，从起始沉淀到沉淀结束，形成
28、具有尖峰的曲线。透析结晶法： 为了使蛋白质溶解度的变化缓慢而且连续，而进行透析的方法；在盐浓度缓慢降低的结晶情况下，进行透析。第六章吸附法1、化学吸附与物理吸附的区别：当吸附剂和吸附物之间作用力是通过分子间引力（范德华力）产生的吸附称为物理吸附，最常见的一种吸附现象。在吸附剂和吸附物之间有电子的转移，发生化学反应而产生化学键，这种吸附称为化学吸附。物理吸附是可逆的，可以是单分子层吸附或多分子吸附，选择性较差。物理吸附与吸附剂的表面积、孔分布和温度等因素有密切的关系。化学吸附的选择性强，即一种吸附剂只对某种或特定几种物质有吸附作用，只能形成单分子层吸附，吸附后较稳定，不易解吸，平衡慢。项目物理吸
29、附化学吸附作用力范德华库仑力吸附力较小，接近液化热较大，接近反应热选择性几乎没有有选择性吸附速度较快，需要活化能很小慢，需要较高的活化能吸附分子层单分子层或多分子层单分子层2、吸附剂及被吸附物的极性对吸附的影响：一般极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质，非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。如活性炭从水中吸附有机化合物；硅胶是极性的，适宜从有机溶剂中吸附极性物质。3、吸附剂用量及吸附剂浓度对于吸附效果的影响：一般吸附物浓度大时，吸附量也大。由于杂质存在，浓度升高后，吸附的杂质量也上升，吸附选择性差。提高吸附选择性，常将料液适当稀
30、释。吸附量是指单位重量吸附剂所吸附物质的量。4 两种以上常用吸附剂的性质，用途。活性炭：吸附能力很强的非极性吸附剂。价格低，来源广。除杂，生化药物的分离。人造沸石：人工合成的无机阳离子交换剂。带正电荷。与钠离子交换。磷酸钙凝胶：吸附作用主要是钙离子与蛋白质负电基团结合。白陶土：活性物质分离纯化的吸附剂，也可作为助滤剂与去除热原的吸附剂。白陶土能吸附分子量较大的杂质，包括导致过敏的物质，常用它脱色。：氧化铝：适用于亲脂性成分的分离价廉，再生容易，活性易控制，操作不便，手续繁琐，处理量有限硅胶：活性强弱与自由水的含量有关，自由水多，活性低，自由水少，活性高。5、大网格高聚物吸附剂与传统吸附剂相比的
31、优点：选择性好、解吸容易，理化性质稳定，机械强度好，反复使用，流体吸力较小。6 术语：正吸附：吸附提取液中的有效成分。负吸附：去除提取液中的杂质。大网格高聚物吸附剂：与大孔网状离子交换树脂具有相同的大网状骨架，保留离子交换树脂的功能团，性质与活性炭、硅胶等吸附剂相似。第七章凝胶层析1、公式 Ve=Vo+KdVi 各字母的含义，凝胶层析的原理。Ve 淋出体积 Vo 粒尖体积 Vi 填料的孔体积 Kd排阻系数或分配系数凝胶层析原理： 平衡排除理论一个高聚物分子的流出体积是由在宏观的流动相和微观的孔体积中的平衡分名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精
32、心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 6 页，共 18 页 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载配系数所决定的。这里所谓的平衡是指扩散的平衡，即溶质分子扩散进入一个填料颗粒孔中且再出来所需要的时间远小于溶质区段在此停留的时间。换言之，当溶质分子流过一个填料颗粒这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。平衡条件只是在流速很慢时一个极端情况。2、常用凝胶的名称、特点及用途。名称特点用途葡聚糖凝胶（ Sephadex G）最常用，稳定，对阳离子轻微吸附，多次重复使用分离修饰葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶化学稳定好，成分不易脱落，
33、适用pH广，机械强度好，无带电基团，分辨率较高琼脂糖类凝胶多孔玻璃微球化学稳定性高、强度大、高压下操作，好的流速；缺点是对糖类、葡萄糖吸附疏水性凝胶只适用分离分子量较小的物质分离不溶水的有机物质3、选择凝胶： 选择何种凝胶及其型号、粒度，一方面是考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离分子量范围， （渗入限与排阻限） ，理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意分离目的和样品的性质。4、好的凝胶层析效果如何选柱、装柱。选柱：层析柱的有效体积与柱比的选择必须根据样品的数量、性质及分离目的加以确定。对于类分离，柱床体积一般微样品溶液体积的5 倍或略微多一些就够了，柱比5：1 或 10：1，对于分级
34、分离，要求柱床体积大于样品体积25 倍以上，柱比在25100 之间。底端支持物满足两个条件：不易阻塞，死腔小。装柱：正式装柱前必须检查柱底的凝胶支持物是否符合要求。要求不漏不堵，不吸附样品，且能保持一定的流速。在装柱时，连续搅拌下小心装柱。开始装柱时，避免胶粒直接冲击支持物，空柱种应约留1/5 的水或溶剂。所用的凝胶必须是用相应溶剂系统充分溶胀的。为了防止柱中出现气泡，凝胶悬液温度必须与室温平衡并用水泵减压排气。进胶过程必须连续、均匀，不要中断，并在不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。5、溶质通过色谱峰时造成的峰加宽效应包括：（1）分子扩散：使用颗粒度小而均匀的填料可以降低扰
35、动作用。（2）涡流扩散： 涡流扩散对凝胶色谱峰的加宽比较重要。应用小而均匀的填料紧密地装在内径适当的柱中可以减少由涡流扩散造成的峰加宽，提高效柱。（3）流动相中传质阻力造成的色谱峰加宽。扩散速度越快，流速不平衡的影响就越小。（4）固定相中传质阻力造成的色谱峰加宽。填充介质粒度越小所造成的峰加宽效应也小。溶液在柱外产生的峰加宽：（1）连接管路（ 2）检测池6、利用凝胶层析测量蛋白质的分子量。测定的依据是不同分子量的物质，只要在凝胶的分离范围内（渗透限与排阻限之间），洗脱体积Ve 及分配系数 Kd值随分子量增加而下降。 对于一个特定体系， 待测定物质洗脱体积与分子量之间的关系：Ve=-KlgM+C
36、 (1) 求解法以两个已知分子量的蛋白质过柱，求出 C和 K，将 待测物的 Ve代入得到 M 。 （2）标准曲线法以多个已知分子量的标准蛋白过柱，测取各自的Ve值。以 Ve作纵坐标， lgM 作横坐标，制作标准曲线。在同一测定体系中测取未知物质的Ve，由标准曲线求得分子量。7 术语柱比：层析柱的长度与直径的比值操作压：凝胶层析由于进出口之间液位差形成的对凝胶颗粒的压力内水体积： 柱中凝胶颗粒内部所含的液相体积。外水体积： 凝胶柱床中凝胶颗粒之间的液相体积。类分离：分开样品分子中分子量悬殊较大的两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。分级分离：分开分子量不很悬殊的大分子物质。排阻系数：表征物质分
37、子进入凝胶颗粒的程度。全渗入： Kd=1 全排阻： Kd=0 分离名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 7 页，共 18 页 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载限. 分辨率： R= Ve/(1/2(Wa +Wb)分辨率与洗脱体积的差值成正比，而与两物质的洗脱峰宽度成反比。第 8 章 离子交换1、离子交换常用洗脱方法：从树脂上洗脱目的物的方法主要有两种：（ 1）调节洗脱液的pH，使目的物粒子在此pH下失去电荷，甚至带相反电荷，从而丧失与原离
38、子交换树脂的结合力而被洗脱下来。（ 2）用高浓度的同性离子根据质量作用定律将目的物离子取代下来。2、离子交换树脂的命名法。举两种树脂骨架。树脂命名编号： 强酸类 1100号， 弱酸类 101200号， 强碱类 201300 号， 弱碱类 301400号， 中强酸 401500。各种树脂除注明类别和编号外，还需标明载体的交联度。书写交联度时，将百分号除去，写在树脂编号后并用乘号“ X”隔开。强酸1X7，交联度为7% 。树脂骨架：（1）苯乙烯型离子交换树脂（2）丙烯酸型阳离子交换树脂（3）多乙烯多胺环氧氯丙烷树脂 （4）聚乙烯砒啶系离子交换树脂（5）其他离子交换树脂蛇笼树脂选择性离子交换树脂热再生
39、离子交换树脂3、离子交换的选择性的因素：一、离子化合价与水合半径的影响二、离子化合价与离子浓度的影响三| 、交换环境的影响（1）溶液的pH （2）离子强度（3）有机溶剂四、树脂结构的影响（1）树脂载体交联度 （2）辅助力（3）其他结合力五、偶极离子排斥作用。4、偶极离子的交换特点：净电荷为零时，正电中心和负电中心并不重叠，遂成偶极。钠型树脂， 被吸附的氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂磺酸基的负电荷产生排斥力。偶极离子的排斥作用，所以使树脂对氨基酸的吸附量大大降低。氢型树脂：由于氨基酸的解离度低，被取代之氢离子为羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶极，故与树脂磺酸基没有排斥力。偶极离子的排斥力随
40、氨基酸的R 基碳链的加长而减弱。适当增加溶液中离子强度，偶极排斥力减弱。5、大孔、均孔树脂的特点：大孔型离子交换树脂的特征：1 载体骨架交联度高，有较好的化学和物理稳定性及机械强度。 2 孔径大， 不受环境条件的影响，动力学性能好， 抗污染能力强， 交换速度快。 3 表面积大，表面吸附能力强，对大分子物质的交换容量大4 孔隙率大，比重大，对小离子的体积交换量比凝胶型树脂小。均孔树脂的特点：主要为阴离子交换树脂，骨架的交联度比较均匀，孔径大小一致，重量和体积交换容量都较高，膨胀度、相对密度适中、机械强度好、抗污染和再生能力强。6、离子交换纤维素的特点及洗脱。离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子
41、物质能自由地在其中扩散和交换，亲水性强，表面积大，易吸附大分子；交换基团稀疏，对分子的实际交换容量大；吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不易引起变性；分辨率强，能分离复杂的生物大分子混合物。洗脱：对离子交换纤维素进行吸附后的洗脱一般比从离子交换树脂的洗脱缓和。升高环境的pH或是降低环境的 pH或增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。7、酸碱性蛋白选择合适的离子交换纤维素。酸性蛋白质（等电点约pH5） ，作为一个阴离子，它的DEAE- 纤维素柱层析可在pH5。59。0 之间进行，蛋白质和交换剂都是解离的，带有相反的电荷。在CM-纤维素上层析则需限制在（pH3.54.5 ）之间。碱性蛋白质（等电点约p
42、H8）作为一个阳离子，用羧甲基纤维素层析可在pH3.7.5 进行。8、离子交换聚焦色谱的原理：（1）pH梯度的形成：色谱聚焦利用离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用，当洗脱缓冲液不断滴到离子交换柱上时，柱内自动形成pH梯度。（2）蛋白质的色谱行为：蛋白质所带电荷取决与他们的等电点和介质的pH.当介质的 pH低于它的等电点时，蛋白质带正电荷，它不与阴离子交换剂结合，随洗脱液向下移动。（3）聚焦效应：当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处，移动速度明显减慢。加上相同的第二个名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - -
43、- - - - - - - - - - - - 第 8 页，共 18 页 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载样品，它将以洗脱液移动的速度下降，直到追到正在慢移的第一个样品成分处（聚焦）。然后这两个样品一起下移，往柱下一起洗脱出来。所有的样品必须在第一个样品峰尚未被洗脱前加入。9 举例三种常用离子交换树脂和离子交换纤维素。大孔型强酸型离子交换树脂大孔型弱酸型离子交换树脂大孔型弱碱型离子交换树脂甲基磺酸纤维素乙基磺酸纤维素二乙基氨基乙基纤维素苄基化的DEAE 纤维素10、术语：CM-C ：羧甲基纤维素。DEAE-C ：二乙氨基乙基纤维素。PBE94 ：多缓冲交换剂尼柯尔斯方程：
44、m1(1/z1) / m2(1/z2) = K c1 / c2.交换容量： meq/g(毫克当量 / 克树脂 ) 树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。偶极离子排斥：被吸附的氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂之负电荷产生排斥力。蛇笼树脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型阴离子交换树脂中聚合而成的一类树脂。第九章亲和层析1、亲和层析原理，主要特点。利用生物体中多数大分子物质具有与某些相应的分子专一型可逆结合的特性。主要特点：经过一此简单的处理就可以获得所需的高纯度活性物质。对设备要求不高，操作简便，使用范围广，特异性强，分离速度快，分离效果好，分离条件温和。缺点是吸附剂的通用性较差。2、选择
45、配基的注意点： （1）配基与配体由足够大的亲和力（2）配基与配体的结合应是专一的（3）配基应具有化学活性。3、手臂，其长短与亲和层析的效果的联系，为什么。由于酶的活性中心常是埋藏在其结构的内部，它们与介质的空间障碍影响其与亲和配基的结合作用。在载体和配基之间插入手臂，以消除空间障碍，手臂的长度是有限的，太短不能起消除空间障碍的作用，太长会使非特异性性吸附增加。4、制作高亲和力的亲和吸附剂: 提高亲和层析效果，固定相的配基和流动相的配基具有较强的亲和力。配基浓度对亲和力的影响。为了将亲和配体和其他物质分开，在实际亲和层析时，通常需要阻流值10。空间障碍的影响：插入适当长度的手臂。配基与载体的结合
46、位点的影响。载体孔径的大小对吸附剂的亲和能力有决定性的作用。微环境的影响，包括载体及手臂的电性、极性、次级键对配基亲和力的影响。5、非专一性吸附包括那些：如何克服。亲和层析中的非专一性吸附有以下情况：（1）离子情况（2）疏水基团 a 长的烃类结构的“手臂” b 疏水性配基（3）复合亲和力确定离子强度以获得良好的分离效果6、亲和层析洗脱方法： （1）非专一性洗脱改变洗脱剂的pH以影响电性基团的解离程度而洗脱（2）特殊洗脱 （3）专一性洗脱竞争性效应非竞争性效应反竞争性效应7、二次作用亲和沉淀: 利用在物理场（如pH 、离子强度、温度和舔加金属离子等）改变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物
47、为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质。亲和介质结合目的分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法。8、亲和膜分离原理及特点：亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。优点： （1）传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率高。（20 压降小，流速快，设备体积小，配基用量低。缺点：理论塔板很低，吸附和清洗率低。9 术语：亲和力：配基对互补分子间的作用力，是制备高效亲和柱的重要参数。亲和吸附剂：载体配基。配基：在亲和层析中起可逆结合的特异性物质。阻流值：Ve/Vo。正洗脱：吸附提取物中的有效成分。负洗脱：去处提取物中的杂质。金属螯合层析：利
48、用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。有机染料亲和层析：有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似于NAD+ 的结构，一些需要核酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具有一定的亲和力，将这些染料共价偶联到纤维素或琼脂等多糖载体上，就制得亲和层析柱。名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 9 页，共 18 页 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载亲和错流过滤： (affinity cross flow filtration)ACFF将亲
49、和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。亲和萃取：利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和作用下促进目标产物在PGE相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。亲和反胶团萃取：是指在反胶团相中除通常的表面活性剂（如AOT ）外，舔加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。第十章离心技术1、相对离心力： （RCF ）离心力与重力的比值。用符号“g” 或 “g” 表示
50、。 RCF=11.18 106N2r (g) 2、离心机转子有几种，各自特点。（1）角度转子：机械强度高，重心低，运转平稳，寿命长，管内温度分布均匀，温差对流小，离心时间短，使用方便，但离心管外壁易产生强烈对流和涡流，同时管外侧会出现沉淀，形成壁效应。（2）水平转子：结构复杂，加工困难，机械强度低，重心高，容量小，低速运转时易摇摆，离心时间长，寿命短而价格高。对流作用小，“壁效应”弱。（3）区带转子： Anderson 转子，无离心管， “十”字隔板将样品槽分为四个扇形室。无壁效应，适用于大量样品的密度梯度及等密度梯度离心。配有附属设备和仪器，操作过程复杂，设备较贵，但离心机使用效率高。（4）