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1、学习好资料第一章 生物药物概论1、生物药物的分类：1基因重组多肽、蛋白类治疗剂 2基因药物 3自然生物药物 4合成与局部合成的药物。DNA 重组药物和基因药物的区分：DNA 重组药物即应用重组DNA 技术包括基因工程技术和蛋白质工程技术制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等；基因药物即以基因物质DNA 或 RNA为根底，争论而成的基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。2、生物药物的作用特点：药理学特性：1药理活性高 2治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效牢靠。3毒副作用较少，养分价值高。4生理副作用常用发生。理化特性：1生物材料中的有效物质含量低，杂质种类多且含
2、量相对较高。2生物活性物质组成构造简洁、稳定性差。3生物材料易染菌，腐败。4生物药物制剂的特别要求。3DNA 重组药物有：1细胞因子干扰素类：-干扰素、-干扰素、-干扰素2细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子：白介素-2IL-2和突变型白介素-2Ser125-IL-2肿瘤坏死因子类主要有 TNF-和TNF-受体。3造血系统生长因子类：粒细胞集落刺激因子G-CSF、巨噬细胞集落刺激因子M-CSF、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子GM-CSF、促红细胞生成素EPO、促血小板生成素TPO 干细胞生长因子SCF4生长因子类：胰岛素样生长因子IGF、表皮生长因子EGF、血小板衍生生长因子PDFD、转化生长因子TGF
3、- 和 TGF- 、神经生长因子及各种神经养分因子。5重组多肽与蛋白质类激素：重组人胰岛素rhInsulin、重组人生长激素rhGH、促卵胞激素FSH、促黄体生成素LH和绒毛膜促性腺激素HCG、重组人白蛋白和重组人血红蛋白6心血管病治疗剂与酶制剂 ：因子、水蛭素、 tpA、rtpA、尿激酶、链激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖脑苷酶及 DNsae 等7重组疫苗与单抗制品：重组乙肝外表抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS 疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗和肿瘤疫苗。4 术语药物：用于预防、诊断、治疗 保健的一类物质。药品：是指用于预防、治疗、诊断人体疾病，有目的地调整人体生理功能并规定有适应证或
4、者功能主治、用法和用量的物质，包括中药材、中药饮片、中成药、化学原料药及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。药品依据其来源可分两大类：自然药物即植物药、动物药和矿物药；合成药包括化学合成药与微生物合成药。自然药物一般来源于自然界，很少有人工加工过程，药物成分相对较简洁。生化药物： biopharmaceutics是利用生物体、生物组织、细胞或其成分，综合应用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。DNA 重组药物：即应用重组 DNA 技术包括基因工程技术
5、和蛋白质工程技术制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等。基因药物：以基因物质RNA 和 DNA 及其衍生物作为治疗的物质根底，包括基因治疗用的重组目的DNA 片段、重组疫苗、反义药物和核酸等。生化药物：是运用生物化学的理论、方法、技术与争论成果，从生物体包括动物、植物、微生物和海洋生物分别、纯化得到的一些重要生理活性物质，经药效学和毒理学争论证明对于疾病的防治是安全有效的一大类药物，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、维生素、激素、糖类、脂类、核酸、核苷酸及其衍生物。反义药物：是以人工合成的 10几十个反义寡核苷酸序列与模板 DNA 或mRNA 互补形成稳定的双链构造， 抑制
6、靶基因的转录和 mRNA 的翻译，从而起到抗肿瘤和抗病毒作用，目前有 20 多种反义药物进入临床试验， 其中 ISIS 是 FDA 批准的第一个反义药物，用于治疗AIDS 病患者的巨噬细胞病毒性视网膜炎。核酸疫苗：将编码某种抗原蛋白的外源基因DNA 或 RNA直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答以到达防病治病的目的。更多其次章生物制药工艺学技术根底1、生物活性物质的浓缩与枯燥的方法：生物活性物质的浓缩：1盐析浓缩 2有机溶剂沉淀浓缩 3用葡聚糖凝胶Sephadex浓缩 4用聚乙二醇PEG浓缩 5超滤浓缩 6真空减压浓缩与薄膜浓缩生物活
7、性物质的枯燥：1减压枯燥 2喷雾枯燥 3冷冻枯燥2 简述生物活性物质分别纯化的主要原理：依据混合物中的不同组分安排率的差异，把它们安排于可用机械方法分别的两个或几个物相中，或者将混合物置于某一相中，外加确定作用力，使多组分安排于不同区域，从而到达分别的目的。主要纯化原理有：1依据分子的外形和大小不同进展分别 2依据分子电离性质带电性的差异进展分别 3依据分子极性大小及溶解度的不同进展分别。4依据物质吸附性质的不同进展分别 5依据配体特意性进展分别3、保存菌种、菌种退化、检查菌种退化常用的菌种保存方法：斜面低温保藏法、液体石蜡封藏法、冷冻枯燥保藏法、液氮超低温保藏法、甘油冷冻保藏法、其他如沙土管
8、保藏法。菌种的退化意味着随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减退或消逝，最终导致养分细胞的死亡。一般把菌株的生活力、产孢子力气的衰退和特别产物产量的下降统称为退化。检查菌种退化：1单位容积中发酵液的活性物质含量 2琼脂平皿上的单菌落形态，3不同培育时期菌体细胞的形态和主要遗传特征，如形成孢子的力气；4发酵过程的 pH 变动状况 5发酵液的气味、色泽4 重组DNA 技术根本原理，如何猎取目的基因基因工程是通过体外重组将甲生物体的基因转入乙受体生物体内进展表达的生物技术。猎取目的基因的方法有：1鸟枪克隆法 2人工合成目的基因 1、酶促方法 2、化学合成法5 常见的基因载体有，如何构建基因重组体在体
9、外将含目的基因的 DNA 片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进展酶切连接，获的重组 DNA 分子。常见的基因载体有：链霉菌质粒、芽孢杆菌载体、质粒、噬菌体phage、黏粒(cosmid)、病毒载体等。6 DNA 重组体有主要有哪几种表达系统？各有什么特点？基因工程包括转录、翻译及翻译后加工等过程。依据宿主细胞种类不同，分为原核基因工程和真核基因工程。原核基因工程以原核细胞作为表达宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌等；而真核基因工程则以真核细胞为表达宿主，如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。（1） 大肠杆菌表达系统：遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便，生殖力强2030min
10、即可生殖一代，便于大规模培育，本钱较低，表达水平较高可达总蛋白的 5%6%，下游技术成熟、易于把握。目前使用最广泛、最成功的表达系统。（2） 酵母表达系统：是真核表达体系，对表达蛋白可进展折叠和翻译后的修饰与糖基化；表达量高，如明胶表达量达 14。8g/L;培育本钱低；适用高密度发酵；杂蛋白少，产物易纯化。（3） 哺乳动物表达系统：中国仓鼠卵巢细胞CHO和猴肾细胞COS优点是能识别和剪切外源基因的内含子并加工成为成熟的 m RNA.但其培育技术难度大，本钱高，争论与生产周期长。表达体系产物产生部位培育方式提纯产物活性潜在危急大肠杆菌多肽、蛋白 菌体内质 或 融 合蛋白质简洁局部可获得高产一般对
11、原核者好真核者稍差不大三体系表达特点比较酵母多肽、蛋白质 或 糖 基化蛋白菌 体 内 或分 泌 出 细胞简洁可高产菌体内，稍简洁真核的接近天然不大哺乳动物细胞完 整 糖 基化蛋白质分 泌 出 细胞较难本钱高可高产简洁几乎可为自然产物需留意有致癌因素7 生物制药工艺中试放大的目的，如何进展中试放大。中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性争论工作，对小试工艺能否成功地进入规模化生产至关重要。这些争论工作都是围围着如何提高收率，改进操作，提高质量，形成批量生产等方面进展。中试放大的方法有阅历放大法，相像放大法和数学模型放大法。主要承受阅历放大法。8 术语微生物纯培育：系指只在单一种类存在的状态下所进
12、展的生物培育。全部微生物、植物和动物都可以进展这种培育，高等植物或动物的无菌培育无菌饲养也可说是一种纯培育。纯培育最重要的是在于微生物的生理争论，方法是依靠灭菌和分别，是由巴斯德LPasteur和柯赫RKoch建立起来的。在自然界中，有的培育条件很困难，特别是具有亲热共生关系的生物及进展寄生性养分的生物；也有一些在理论上不行能进展纯粹培育的生物。诱变育种：是指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。诱变育种主要包括动身菌株的选择、诱变处理和筛选突变株 3 个局部。蛋白质工程：在基因水平上设计表达功能蛋白。
13、转基因动物：将外源基因导入哺乳动物的受精卵或胚胎中，使导入基因与受精卵染色体整合，并将外源基因稳定地子代，使子代表现外源基因的性状。蛋白质组学：争论细胞、组织或个体全部蛋白质的全部表达状态与功能状态，是后基因时代重要争论方向第三章、生物材料的预处理1、去处发酵液中的杂蛋白的方法：1参与分散剂 2参与絮凝剂 3变性沉淀 4吸附 5等电点沉淀6加各种沉淀剂2、去处发酵液中的钙、镁、铁离子的方法：1离子交换法 去铁离子2沉淀法 钙与草酸钠或草酸 镁的去处用草酸沉淀不完全，碱性条件下用磷酸盐，或三聚磷酸钠，生成络合物污染河水3、影响絮凝效果的主要因素： 絮凝剂分子量、絮凝剂用量、pH 及操作条件絮凝剂
14、分子量越大，链越长，吸附桥架效果就越明显，但分子链越大，絮凝剂在水中的溶解度降低； 絮凝剂浓度越低，增加用量有助于架桥，提高絮凝效果，但过多引起吸附饱和，在胶粒外表形成掩盖层，使胶粒稳定，降低絮凝效果；pH 的变化影响离子型絮凝剂功能团的电离度，电离度的提高使电排斥作用增加，架桥力气最正确；搅拌应留意，刚开头搅拌快速使絮凝剂分散，发挥絮凝作用，絮凝团形成后，高的剪切力会打碎絮凝团。4 细胞裂开：方法原理特点机法械匀浆法基于液相的剪切力适用面广，处理量大，速度快，工业广泛使用，不适用某些高度分支微生物，产热大，可能会生物活性物质失活珠磨法研磨作用裂开适用面广，处理量大，工业广泛使用，产热大，可能
15、会生物活性物质失活超声波超声波的空穴作用裂开产热大，散热不易，本钱高，适用小量样品裂开物法理枯燥法菌体细胞膜渗透性变化，自溶较猛烈，易引起蛋白质或其他组分变性冻融法胞内冰晶引起细胞膨胀裂开较温存，但裂开作用较弱，常需反复冻融，试验室使用渗透压冲击法渗透压突然变化，细胞快速膨胀变化较温存，但裂开作用较弱，常与酶法合用化法学化学试剂处理化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞成分需选择适宜的试剂，削减对活性物质的破坏，可应用于大规模生产制成丙酮粉丙酮快速脱水，破坏蛋白质与脂质结合的键快速脱水，削减蛋白质变性，促进某些结合酶释放生法物酶解法用酶反响分解破坏细胞壁上特有的化学键反响条件温存，但本钱较高，一般仅适
16、用于小规模应用组织自溶法利用组织中酶转变、破坏细胞构造、使组织自溶反响条件温存、本钱低，不适用于易受酶降解的目的物的提取5、超声波裂开细胞的原理：超声波的裂开作用与液体中空穴的形成有关。当超声波在液体中传播时，液体中的某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。由于拉力的作用，消灭细小的空穴。这种空穴泡在超声波的连续作用下，又快速闭合，产生一个极为猛烈的冲击波压力，由它引起的黏滞性旋涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使其内部液体发生流淌，而使细胞裂开。术语：1、 分散作用：coagulation是指在某些电解质的作用下，使胶体粒子的集中双电层的排斥作用降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚
17、拢的过程。2、 絮凝作用：flocculation是指在胶体悬浮液中参与絮凝剂后，胶粒可猛烈吸附在絮凝剂外表的功能团上，而且一个高分子聚合物的很多链节分别吸附在不同颗粒的外表上，产生架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀的过程。3、 渗透压冲击法：把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压的作用，细胞外的水分便向外渗出，细胞发生收缩，当到达平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分快速渗入胞内，使细胞快速膨胀而裂开，使产物释放到溶液中。4、 错流过滤：滤液给过滤介质外表一个平行的大流量冲刷，则过滤截止外表积存的滤饼就会削减到可以无视的程度，而通过过滤介质的流速却比较小。第
18、四章 萃取法1、溶液萃取法的根本原理：如某一抗生素在有机溶剂不溶于水中溶解度较大，当料液与有机溶剂接触后，抗生素就从水相转移到有机相中。另外，抗生素在不同 pH 条件下，可以有不同的化学状态如游离态酸、碱或成盐，其安排系数亦有差异，假设适度转变pH，可将抗生素自有机相再转入水相，这样反复萃取，可以到达浓缩和提纯的目的。2、溶液萃取法按操作方式不同，可分为单级萃取和多级萃取，后者分为错流萃取和逆流萃取。当萃取剂 用量一样时，二级萃取收率比单级萃取收率高，在萃取用量确定的状况下，萃取次数愈多，则萃取愈完全。多级逆流与错流萃取相比，萃取剂耗量较少，萃取液平均浓度较高。3、乳化剂能使乳化液稳定：1、界
19、面膜形成外表活性剂分子聚拢在界面上，形成严密吸附层，在分散相外表形成保护层。（2） 、界面电荷的影响：O/W 型乳状液油滴多数是带负电的，W/O 型乳状液中水滴则带正电。产生排斥力。（3） 、介质黏度：乳化剂能增加乳状液的黏度，增加保护膜的机械强度，则形成的界面膜不易被破坏， 并可阻挡液珠的聚结。4、破坏乳化剂的方法：1、参与外表活性剂 2离心 3加电解质 4加热 5吸附法破乳 6高压电破乳 7稀释法 8其他途径 ：超滤、反响萃取、中性磷萃取、脂肪类萃取剂5、影响乳化剂类型的因素有： 1乳化和破乳化 2pH 的影响 3温度和萃取时间的影响 4 盐析作用的影响 5溶剂种类、用量及萃取方式的选择6
20、、影响双水相萃取的因素： 1成相高聚物的分子量 2成相高聚物浓度界面张力 3电化学安排盐类的影响 4疏水效应 5温度及其他因素7、影响超临界流体萃取的因素：1压力的影响 2温度的影响 3助溶剂 4物料性质的影响8 术语双水相萃取：不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统，利用物质在互不相溶的两水相安排系数的差异来进展萃取的方法。双节线：高聚物P、Q 的浓度均以重量百分含量表示，相图右上部为两相区，右下部为均相区，两相与均相的分界限叫双节线多级错流萃取：料液经萃取后的萃余液再用颖萃取剂进展萃取的方法。多级逆流萃取：在第一级中参与料液F，萃余液挨次作为后一级的料液，而在最终一级参与萃取剂S，萃
21、取液挨次作为前一级的萃取剂。由于料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为逆流萃取。反胶束萃取：外表活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，在有机溶剂内形成聚拢体， 其中外表活性剂的非极性基团在外，与非极性的溶剂接触，而极性基团在外，形成极性核，从而能够溶解极性物质，进展萃取。超临界流体萃取：supercritical fluid SCF是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解力气来进展分别纯化的技术。第五章 沉淀和结晶1、盐析沉淀是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入确定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而到达纯化
22、目的的方法。根本原理：一、盐离子与蛋白质外表具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子局部中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互结合。二、中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，疏水区相互作用，使其沉淀。2、影响盐析效果的因素：1无机盐的种类 2溶质蛋白质种类的影响 3蛋白质浓度的影响 4温度的影响 5pH 的影响3、影响沉淀效果的因素：1有机溶剂种类及用量 2pH 的影响 3温度 4无机盐的含量 5某些金属离子的助沉淀作用 6样品浓度4、形成过饱和溶液的方法：1蒸发法 2温度诱导法 3盐析结晶法 4透析结晶法 5有机溶剂
23、结晶法 6等电点法 7微量集中法 8化学反响结晶法 9共沸蒸馏结晶5、影响晶体大小的因素：1过饱和度 ：增加过饱和度能使成核速度和晶体生长速度加快，对前者影响较大，过饱和度增加，晶体较细小。2温度 快速冷却，到达较高的过饱和度，晶体细小形成针状晶；反之，缓慢冷却得到较粗大的晶体。3搅拌速度：搅拌能促进成核和加快集中，提高晶核长大的速度，过快则晶体会被打碎。阅历说明，搅拌速度愈快，晶体愈细。4晶种 参与晶种能诱导结晶，还能把握晶体的外形、大小和均匀度。6、等电点沉淀的特点，如何应用对于两性物质，等电点时净电荷为零，使稳定的双电层及水化膜变弱或破坏，分子间排斥电位降低，吸引力增大，相互聚拢，产生沉
24、淀。等电点沉淀法操作简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物质少，常用的纯化方法，主要适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质。应用：胰岛素纯化时，在pH8。0 除去碱性杂蛋白，调 pH3。0 除去酸性杂蛋白，粗提液经此处理后纯度大大提高，有利于后步提取操作。7 术语Ks 盐析：在确定的pH 和温度下转变离子强度盐浓度进展盐析。盐析：在确定离子强度下仅转变 pH 和温度进展盐析。盐析分布曲线：蛋白质沉淀的速度可用dS/dP 对盐饱和度P作图表示。蛋白质沉淀的速率开头时格外快速，以后变慢，从起始沉淀到沉淀完毕，形成具有尖峰的曲线。透析结晶法：为了使蛋白质溶解度的变化缓慢而且连续，而进展透析的方
25、法；在盐浓度缓慢降低的结晶状况下，进展透析。第六章 吸附法1、化学吸附与物理吸附的区分：工程作用力 吸附力 选择性 吸附速度吸附分子层物理吸附范德华较小，接近液化热几乎没有较快，需要活化能很小单分子层或多分子层化学吸附库仑力较大，接近反响热有选择性慢，需要较高的活化能单分子层当吸附剂和吸附物之间作用力是通过分子间引力范德华力产生的吸附称为物理吸附，最常见的一种吸附现象。在吸附剂和吸附物之间有电子的转移，发生化学反响而产生化学键，这种吸附称为化学吸附。物理吸附是可逆的，可以是单分子层吸附或多分子吸附，选择性较差。物理吸附与吸附剂的外表积、孔分布和温度等因素有亲热的关系。化学吸附的选择性强，即一种
26、吸附剂只对某种或特定几种物质有吸附作用， 只能形成单分子层吸附，吸附后较稳定，不易解吸，平衡慢。2、吸附剂及被吸附物的极性对吸附的影响：一般极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质，非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。如活性炭从水中吸附有机化合物；硅胶是极性的，适宜从有机溶剂中吸附极性物质。3、吸附剂用量及吸附剂浓度对于吸附效果的影响：一般吸附物浓度大时，吸附量也大。由于杂质存在，浓度上升后，吸附的杂质量也上升，吸附选择性差。提高吸附选择性，常将料液适当稀释。吸附量是指单位重量吸附剂所吸附物质的量。4 两种以上常用吸附剂的性质，用
27、途。活性炭：吸附力气很强的非极性吸附剂。价格低，来源广。除杂，生化药物的分别。人造沸石： 人工合成的无机阳离子交换剂。带正电荷。与钠离子交换。磷酸钙凝胶：吸附作用主要是钙离子与蛋白质负电基团结合。白陶土：活性物质分别纯化的吸附剂，也可作为助滤剂与去除热原的吸附剂。白陶土能吸附分子量较大的杂质，包括导致过敏的物质，常用它脱色。：氧化铝：适用于亲脂性成分的分别价廉，再生简洁，活性易把握，操作不便，手续繁琐，处理量有限硅胶：活性强弱与自由水的含量有关，自由水多，活性低，自由水少，活性高。5、大网格高聚物吸附剂与传统吸附剂相比的优点：选择性好、解吸简洁，理化性质稳定，机械强度好，反复使用，流体吸力较小
28、。6 术语：正吸附：吸附提取液中的有效成分。负吸附：去除提取液中的杂质。大网格高聚物吸附剂：与大孔网状离子交换树脂具有一样的大网状骨架，保存离子交换树脂的功能团，性质与活性炭、硅胶等吸附剂相像。第七章 凝胶层析1、公式 Ve=Vo+KdVi 各字母的含义，凝胶层析的原理。Ve 淋出体积 Vo 粒尖体积 Vi 填料的孔体积 Kd排阻系数或安排系数凝胶层析原理：平衡排解理论 一个高聚物分子的流出体积是由在宏观的流淌相和微观的孔体积中的平衡分配系数所打算的。这里所谓的平衡是指集中的平衡，即溶质分子集中进入一个填料颗粒孔中且再出来所需要的时间远小于溶质区段在此停留的时间。换言之，当溶质分子流过一个填料
29、颗粒这段距离时，溶质分子已屡次进出于填料的孔，到达平衡。平衡条件只是在流速很慢时一个极端状况。2、常用凝胶的名称、特点及用途。名称葡聚糖凝胶Sephadex G特点最常用，稳定，对阳离子略微吸附，屡次重复使用用途分别修饰葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶化学稳定好，成分不易脱落，适用pH 广，机械强度好，无带电基团，区分率较高琼脂糖类凝胶多孔玻璃微球疏水性凝胶化学稳定性高、强度大、高压下操作，好的流速；缺点是对糖类、葡萄糖吸附只适用分别分子量较小的物质分别不溶水的有机物质3、选择凝胶：选择何种凝胶及其型号、粒度，一方面是考虑凝胶的性质，包括凝胶的分别分子量范围，渗入限与排阻限，理化稳定性、强度、非特异吸
30、附性质等；另一方面还要留意分别目的和样品的性质。4、好的凝胶层析效果如何选柱、装柱。选柱：层析柱的有效体积与柱比的选择必需依据样品的数量、性质及分别目的加以确定。对于类分别，柱床体积一般微样品溶液体积的 5 倍或略微多一些就够了，柱比5：1 或 10：1，对于分级分别，要求柱床体积大于样品体积 25 倍以上，柱比在 25100 之间。底端支持物满足两个条件：不易堵塞，死腔小。装柱：正式装柱前必需检查柱底的凝胶支持物是否符合要求。要求不漏不堵，不吸附样品，且能保持确定的流速。在装柱时，连续搅拌下留神装柱。开头装柱时，避开胶粒直接冲击支持物，空柱种应约留 1/5 的水或溶剂。所用的凝胶必需是用相应
31、溶剂系统充分溶胀的。为了防止柱中消灭气泡，凝胶悬液温度必需与室温平衡并用水泵减压排气。进胶过程必需连续、均匀，不要中断，并在不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。5、溶质通过色谱峰时造成的峰加宽效应包括：（1） 分子集中：使用颗粒度小而均匀的填料可以降低扰动作用。（2） 涡流集中：涡流集中对凝胶色谱峰的加宽比较重要。应用小而均匀的填料严密地装在内径适当的柱中可以削减由涡流集中造成的峰加宽，提高效柱。（3） 流淌相中传质阻力造成的色谱峰加宽。集中速度越快，流速不平衡的影响就越小。（4） 固定相中传质阻力造成的色谱峰加宽。填充介质粒度越小所造成的峰加宽效应也小。溶液在柱外产生的峰加
32、宽：1连接收路2检测池6、利用凝胶层析测量蛋白质的分子量。测定的依据是不同分子量的物质，只要在凝胶的分别范围内渗透限与排阻限之间，洗脱体积 Ve 及安排系数 Kd 值随分子量增加而下降。对于一个特定体系，待测定物质洗脱体积与分子量之间的关系：Ve=-KlgM+C (1)求解法 以两个分子量的蛋白质过柱，求出 C 和K，将 待测物的 Ve 代入得到M。2标准曲线法 以多个分子量的标准蛋白过柱，测取各自的Ve 值。以Ve 作纵坐标，lgM 作横坐标，制作标准曲线。在同一测定体系中测取未知物质的 Ve，由标准曲线求得分子量。7 术语柱比：层析柱的长度与直径的比值 操作压：凝胶层析由于进出口之间液位差
33、形成的对凝胶颗粒的压力内水体积：柱中凝胶颗粒内部所含的液相体积。外水体积：凝胶柱床中凝胶颗粒之间的液相体积。类分别： 分开样品分子中分子量悬殊较大的两类物质，并不要求分别分子量相近的组分。分级分别：分开分子量不很悬殊的大分子物质。排阻系数：表征物质分子进入凝胶颗粒的程度。全渗入： Kd=1 全排阻：Kd=0 分别限.区分率：R=Ve/(1/2(Wa +Wb)区分率与洗脱体积的差值成正比，而与两物质的洗脱峰宽度成反比。第 8 章 离子交换1、离子交换常用洗脱方法：从树脂上洗脱目的物的方法主要有两种：（1） 调整洗脱液的 pH，使目的物粒子在此 pH 下失去电荷，甚至带相反电荷，从而丧失与原离子交
34、换树脂的结合力而被洗脱下来。（2） 用高浓度的同性离子依据质量作用定律将目的物离子取代下来。2、离子交换树脂的命名法。举两种树脂骨架。树脂命名编号：强酸类 1100 号，弱酸类 101200 号，强碱类 201300 号，弱碱类301400 号，中强酸 401500。各种树脂除注明类别和编号外，还需标明载体的交联度。书写交联度时，将百分号除去，写在树脂编号后并用乘号“X”隔开。强酸 1X7，交联度为 7%。树脂骨架：1苯乙烯型离子交换树脂 2丙烯酸型阳离子交换树脂 3多乙烯多胺环氧氯丙烷树脂 4聚乙烯砒啶系离子交换树脂 5其他离子交换树脂 蛇笼树脂选择性离子交换树脂 热再生离子交换树脂3、离子
35、交换的选择性的因素：一、离子化合价与水合半径的影响 二、离子化合价与离子浓度的影响 三|、交换环境的影响 1溶液的 pH 2离子强度 3有机溶剂 四、树脂构造的影响 1树脂载体交联度 2关心力 3其他结合力 五、偶极离子排斥作用。4、偶极离子的交换特点：净电荷为零时，正电中心和负电中心并不重叠，遂成偶极。钠型树脂，被吸附的氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂磺酸基的负电荷产生排斥力。偶极离子的排斥作用， 所以使树脂对氨基酸的吸附量大大降低。氢型树脂：由于氨基酸的解离度低，被取代之氢离子为羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶极，故与树脂磺酸基没有排斥力。偶极离子的排斥力随氨基酸的 R 基碳链的加长而
36、减弱。适当增加溶液中离子强度，偶极排斥力减弱。5、大孔、均孔树脂的特点：大孔型离子交换树脂的特征：1 载体骨架交联度高，有较好的化学和物理稳定性及机械强度。2 孔径大，不受环境条件的影响，动力学性能好，抗污染力气强，交换速度快。3 外表积大， 外表吸附力气强，对大分子物质的交换容量大 4 孔隙率大，比重大，对小离子的体积交换量比凝胶型树脂小。均孔树脂的特点：主要为阴离子交换树脂，骨架的交联度比较均匀，孔径大小全都，重量和体积交换容量都较高，膨胀度、相对密度适中、机械强度好、抗污染和再生力气强。6、离子交换纤维素的特点及洗脱。离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子物质能自由地在其中集中和交换，亲
37、水性强，外表积大，易吸附大分子；交换基团稀疏，对分子的实际交换容量大；吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不易引起变性； 区分率强，能分别简洁的生物大分子混合物。洗脱：对离子交换纤维素进展吸附后的洗脱一般比从离子交换树脂的洗脱缓和。上升环境的 pH 或是降低环境的 pH 或增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。7、酸碱性蛋白选择适宜的离子交换纤维素。酸性蛋白质等电点约 pH5，作为一个阴离子，它的 DEAE-纤维素柱层析可在 pH5。59。0 之间进展，蛋白质和交换剂都是解离的，带有相反的电荷。在CM-纤维素上层析则需限制在pH3.54.5之间。碱性蛋白质等电点约 pH8作为一个阳离子，用羧甲基纤维
38、素层析可在pH3.7.5 进展。8、离子交换聚焦色谱的原理：（1） pH 梯度的形成：色谱聚焦利用离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用，当洗脱缓冲液不断滴到离子交换柱上时，柱内自动形成 pH 梯度。（2） 蛋白质的色谱行为：蛋白质所带电荷取决与他们的等电点和介质的pH.当介质的 pH 低于它的等电点时，蛋白质带正电荷，它不与阴离子交换剂结合，随洗脱液向下移动。（3） 聚焦效应：当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处，移动速度明显减慢。加上一样的其次个样品，它将以洗脱液移动的速度下降，直到追到正在慢移的第一个样品成分处聚焦。然后这两个样品一起下移，往柱下一起洗脱出来。全部的样品必需在第一个样品峰
39、尚未被洗脱前参与。9 举例三种常用离子交换树脂和离子交换纤维素。大孔型强酸型离子交换树脂 大孔型弱酸型离子交换树脂 大孔型弱碱型离子交换树脂甲基磺酸纤维素 乙基磺酸纤维素 二乙基氨基乙基纤维素 苄基化的 DEAE 纤维素10、术语：CM-C：羧甲基纤维素。DEAE-C：二乙氨基乙基纤维素。PBE94：多缓冲交换剂尼柯尔斯方程：m1(1/z1) / m2(1/z2) = K c1 / c2.交换容量：meq/g(毫克当量/克树脂) 树脂再生：使用过的树脂重获得使用性能的处理过程。偶极离子排斥：被吸附的氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂之负电荷产生排斥力。 蛇笼树脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型阴离子
40、交换树脂中聚合而成的一类树脂。第九章 亲和层析1、亲和层析原理，主要特点。利用生物体中多数大分子物质具有与某些相应的分子专一型可逆结合的特性。主要特点：经过一此简洁的处理就可以获得所需的高纯度活性物质。对设备要求不高，操作简便，使用范围广，特异性强，分别速度快，分别效果好，分别条件温存。缺点是吸附剂的通用性较差。2、选择配基的留意点：1配基与配体由足够大的亲和力2配基与配体的结合应是专一的3配基应具有化学活性。3、手臂，其长短与亲和层析的效果的联系，为什么。由于酶的活性中心常是埋藏在其构造的内部，它们与介质的空间障碍影响其与亲和配基的结合作用。在载体和配基之间插入手臂，以消退空间障碍，手臂的长
41、度是有限的，太短不能起消退空间障碍的作用，太长会使非特异性性吸附增加。4、制作高亲和力的亲和吸附剂:提高亲和层析效果，固定相的配基和流淌相的配基具有较强的亲和力。配基浓度对亲和力的影响。为了将亲和配体和其他物质分开，在实际亲和层析时，通常需要阻流值 10。空间障碍的影响：插入适当长度的手臂。配基与载体的结合位点的影响。载体孔径的大小对吸附剂的亲和力气有打算性的作用。微环境的影响，包括载体及手臂的电性、极性、次级键对配基亲和力的影响。5、非专一性吸附包括那些：如何抑制。亲和层析中的非专一性吸附有以下状况：1离子状况 2疏水基团 a 长的烃类构造的“手臂” b 疏水性配基 3复合亲和力 确定离子强
42、度以获得良好的分别效果6、亲和层析洗脱方法：1非专一性洗脱 转变洗脱剂的 pH 以影响电性基团的解离程度而洗脱2特别洗脱 3专一性洗脱 竞争性效应 非竞争性效应 反竞争性效应7、二次作用亲和沉淀:利用在物理场如pH、离子强度、温度和舔加金属离子等转变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质。亲和介质结合目的分子后，通过转变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法。8、亲和膜分别原理及特点：亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。 优点：1传质阻力小，到达吸附平衡的时间短，配基利用率高。 20 压降小，流速快，设备
43、体积小，配基用量低。 缺点：理论塔板很低，吸附和清洗率低。9 术语：亲和力：配基对互补分子间的作用力，是制备高效亲和柱的重要参数。亲和吸附剂：载体配基。配基： 在亲和层析中起可逆结合的特异性物质。阻流值：Ve/Vo。正洗脱：吸附提取物中的有效成分。负洗脱：去处提取物中的杂质。金属螯合层析：利用金属离子的络合或形成螯合物的力气吸附蛋白质的分别系统。有机染料亲和层析：有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似于NAD+的构造，一些需要核酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具有确定的亲和力，将这些染料共价偶联到纤维素或琼脂等多糖载体上，就制得亲和层析柱。亲和错流过滤：(affinity cross flow
44、 filtration)ACFF 将亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反响后，用膜进展错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。亲和萃取：利用偶联亲和配基的 PEG 为成相聚合物进展目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和作用下促进目标产物在 PGE 相上相的安排，提高目标产物的安排系数和选择性。亲和反胶团萃取：是指在反胶团相中除通常的外表活性剂如 AOT外，舔加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助外表活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的安排， 提高目标产物的安排系数和反胶团萃取分别的选择性。第十章 离心技术1、相对离心力：RCF离心力与重力的比
45、值。用符号“g” 或 “g” 表示。 RCF=11.18 10 6 N 2 r (g)2、离心机转子有几种，各自特点。（1） 角度转子：机械强度高，重心低，运转平稳，寿命长，管内温度分布均匀，温差对流小，离心时间短， 使用便利，但离心管外壁易产生猛烈对流和涡流，同时管外侧会消灭沉淀，形成壁效应。（2） 水平转子：构造简洁，加工困难，机械强度低，重心高，容量小，低速运转时易摇摆，离心时间长， 寿命短而价格高。对流作用小，“壁效应”弱。（3） 区带转子：Anderson 转子，无离心管，“十”字隔板将样品槽分为四个扇形室。无壁效应，适用于大量样品的密度梯度及等密度梯度离心。配有附属设备和仪器，操作
46、过程简洁，设备较贵，但离心机使用效率高。（4） 垂直管转子：特别类型的定角转子。离心时的碰撞及温差引起的对流不显著。颗粒沉降时间短，可用于差速、密度梯度及等密度离心，用于平衡等密度离心时效果最正确。（5） 连续离子转子：低速或高速离心机转子，可用于超速离心机。构造简洁，低速时加样，高速时排出清夜。用于试验室，也可用于小规模生产，最适宜自培育液中收集菌体及细胞。（6） 细胞洗脱转子：低速离心时连续分别型转子，最高转速不超过 6000r/min。最适于自动植物培育液或发酵液中连续分别单细胞和菌体，回收浓度及回收率均较高。3、速度区带离心的特点及其用途：离心操作时将样品液置于连续或不连续线形或非线形密度梯度液上，把握离心时间，使所需组分通过局部梯度液，形成的分别区带在到达其等密度区之前即停顿离心。速度区带