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1、医学免疫学实验,一、凝集试验吞噬试验二、沉淀试验溶血反应三、免疫标记技术；免疫细胞的分离；细胞免疫功能测定,实验一,（一）凝集试验1、直接凝集反应（ABO血型鉴定）2、间接凝集反应（类风湿因子测定）3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（二）吞噬试验（示教）（310室）1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）,（一）凝集试验1、直接凝集反应（ABO血型鉴定）2、间接凝集反应（类风湿因子测定）3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（什么是凝集试验或直接、间接、协同凝集试验？）,免疫学检测技术,利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对
2、象的实验过程。一、抗原抗体的检测凝集试验二、免疫细胞功能的检测吞噬试验三、其他，如细胞因子的检测,如何检测抗原或抗体？（基本原则）,抗原抗体抗原抗体反应现象（抗原抗体结合反应的高度特异性）？抗体抗原?,有现象（有相应抗原）,无现象（无相应抗原）,有反应现象（有相应抗体),无反应现象（无相应抗体）,抗原抗体反应的可见性与抗原抗体比例：（形成可见的大抗原抗体复合物合适条件：）,AgAbAgAb,AgAbAg,Ab,Ab,Ab,Ab,Ag,Ag、Ab比例合适：,AgAb：,AgAb：,Ag,Ab,Ab,Ab,，游离Ab,Ab,Ag,Ag,，游离Ag,(visible),（凝集或沉淀）,(unvisi
3、ble),8,(Visible),9,Antigenadded,Antibodyexcesszone,Equivalencezone,Antigenexcesszone,Immunecomplex,【凝集反应】：（1）概念：颗粒性AgAb（凝集块）可溶性AgAb（沉淀物）,AgAbAg,Ab,Ab,Ag,Ab,Ab,（凝集反应）,（细菌、细胞）,AgAbAg,Ab,Ab,Ag,（蛋白质、多糖）,Ab,（沉淀反应）,颗粒性AgAb凝集块（直接凝集反应）,可溶性Ag载体Ab凝集块（间接凝集反应）（细胞、细菌等）（正向间接凝集反应）可溶性Ag载体Ab凝集块（反向间接凝集反应）Ag金葡菌Ab凝集块（协
4、同凝集反应）,一定条件,（2）类型,（致敏载体?）,（3）凝集试验检测原理,颗粒性AgAb凝集块（直接凝集反应）？已知AbAg金葡菌Ab凝集块（协同凝集反应）？金葡菌已知Ab,凝集（有对应Ag）,无凝集（无对应Ag）,一定条件,一定条件,凝集（有对应Ag）,无凝集（无对应Ag）,一定条件,（一）1、ABO血型鉴定,直接凝集反应：颗粒性抗原+抗体凝集块RBC抗A或抗B凝集块,血型RBC抗原抗A抗BAA抗原BB抗原AB有A、BO无A、B,实验步骤：,1、制备红细胞悬液。2、加抗A或抗B。3、加红细胞悬液。4、结果观察。（2人/组）,Bilateralisoftheringfingertip,（一）
5、2、血清类风湿因子测定,正向间接凝集反应、血球凝集试验：可溶性Ag载体Ab凝集人IgG-红细胞类风湿因子（致敏红细胞）（待测）（半定量）（效价）,效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应现象（及以上）的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。,1.稀释液50l5050505050505050ul+ve,2.待检血清（1：10）（Ab?）,50ul,Ab稀释度1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:2560,弃去50,910,50ul505050505050,50ul,1.稀释液50l5050505050505050ul+ve,2.待检血清（1：10）
6、（Ab?）,50,3.加Ag50l5050505050505050ul50Ab最终稀释度1:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120,4.现象,（效价）,1:320,+-1:160,1:40,+-1:40,5.效价1：40，判断待检标本为抗体（类风湿因子）阳性；否则阴性,1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:2560,弃去50,50ul,+,+-+,可能结果1：,第1孔2345678910,+,Result1:,+,Agglutinationdeposition,-vecontrol,+vecontrol,123456789
7、10,+-,standardstojudgeagglutination:,+alltheredbloodcellsagglutinate+mostredbloodcellsagglutinate+halfredbloodcellsagglutinatenoagglutination,all,agg.most,agg.half,agg.few,agg.noagglutination,+-,（+）（+）,all,agg.most,agg.half,agg.few,agg.noagglutination,+-+,1:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120,ti
8、teris1:640;So,titer1:40,Testsample(sampleserum)ispositive.Rheumatoidfactorispositive.Rheumatoidfactorisatrelativelyhighconcentration.,Agglutinationdeposition,(result1),+-+,+,1:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120,maybe,titeris1:5120,or1:5120,So,titer1:40,Testsample(samplesera)ispositive.Rheumatoi
9、dfactorispositive,inhighlevel.,Agglutinationdeposition,(result2),+-+,1:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120,titeris?,(titer1:40,ortiter1:40?)Testsample(sampleserum,rheumatoidfactor)ispositiveornegative?,Agglutinationdeposition,(result3),Titer：Themaximumdilutionthatgivesobviouslyvisibleagglutinati
10、on(+)iscalledthetiter.Titer：Thehighestdilutionoftheserumcapableofagglutinatinghalfoftheredbloodcells(+)istheagglutinationtiter.Theresultsarealsoreportedasthereciprocalofthemaximaldilutionthatgivesvisibleagglutination.,27,So,Titer,1:320(or320),Titer,1:160(or160),Titer,1:20(or20),28,IfTiter1:40(or40),
11、positive(Abpositive)IfTiter1:40(or40),negative(Abnegative)Titer,1:320(or320),1:40(40),rheumatoidfactorpositiveTiter,1:160(or160),1:40(40),rheumatoidfactorpositiveTiter,1:20(or20),1:40(40),rheumatoidfactornegative,29,（一）3、协同凝集试验,金葡菌SPA已知抗体（致敏金葡菌）,Ag金葡菌Ab凝集块(协同凝集反应),请按照实验指导讲义方法进行操作；注意观察第1格内的凝集现象，并分析第2
12、、3格为何不出现凝集。,1.Ab-s.aureusAb-s.aureuss.aureus2.CSF(Ag)normalsalineCSF(Ag)3.joggle,4.(result)agglutinateCSF:cerebrospinalfluidfromthepatientwithmeningitis,Therearemeningococcuses(Ag)inCSFfromthepatientwithbacterialmeningitis.(twopersonseachgroup),先做类风湿因子测定微量移液器的使用,HowtoUseaMicropipettor,Setthedesiredv
13、olumebyturningthecentrallylocatedrings.(Neverexceedtheupperorlowerlimitsofpipettors.20200ul)Placeatiponthedischargeendofthepipettor.Depresstheplungeruntilyoufeeltheinitialresistanceandinserttipintothesolution,justbarelybelowthesurfaceoftheliquidandnotasdeepaspossible.(foraccurate/precisevolume),Care
14、fullyandslowlyreleaseplunger.(Allowthepipettiptofilltofinalvolumebeforeremovingitfromsolutiontoavoidthepresenceofbubblesintheplastictip.)Dischargethesolutionintotheappropriatecontainerbydepressingplunger.Remembertochangetipsbetweensolutionstoavoidmixingorcontaminatingthesolutionsused.,（二）非特异性免疫实验吞噬试
15、验（示教）,1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）了解小吞噬试验检测意义、原理，观察中性粒细胞及其吞噬的葡萄球菌；（310室）2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）了解大吞噬试验检测意义、原理，观察巨噬细胞及其吞噬的鸡红细胞。（310室）,吞噬百分率=100%吞噬指数=100%,吞噬细菌的中性粒细胞数,观察记录的中性粒总数(100),被吞噬的细菌总数,观察记录的吞噬细胞总数(100),Phagocyticcells,monocyte,neutrophil,Phagocyticcells,中性粒细胞内的脑膜炎奈瑟菌_革兰染色,脑膜炎奈瑟菌,噬血细胞综合征骨髓涂片中出现体积较大的噬血组织细胞，吞噬物为形态完
16、整的白细胞，有核红细胞，成熟红细胞及血小板，亦可为不完整的细胞及细胞碎片等,噬血细胞综合征和噬血细胞噬血细胞：巨噬细胞大小为2040微米，或更大，胞浆丰富，吞噬多个成熟红细胞，或幼红细胞或血小板等,实验报告（今天交）：,附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验,一、检查血清免疫球蛋白(即抗体)有无异常或缺陷；二、检查外周血象和淋巴细胞计数；三、做皮肤迟发性超敏反应试验；,附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验,当怀疑免疫缺陷时，建议进行实验室筛查试验，包括全部血细胞计数及分类计数（淋巴细胞计数）和血小板计数;测定IgG，IgM和IgA浓度;抗体功能测定等；若所有这些筛查试验均正常，则免疫缺陷(特别是
17、抗体缺陷)可排除。但若证实有慢性感染，病史毫无疑问或筛查试验阳性，则必须进一步作高级试验检查。,B细胞(抗体)缺陷的试验,只要总免疫球蛋白很低(200mg/dl)，就可确立抗体缺陷的诊断，再结合其他一些试验用于确定具体的疾病和检定有无其他免疫缺陷如用荧光抗B细胞特异抗体(如CD19，CD20)经流式细胞仪来计算B细胞进一步进行血清IgG亚类，IgD和IgE浓度测定等,T细胞缺陷的试验,1.胸部X线检查是筛查婴儿T细胞缺陷的有用方法（如看不到胸腺影像，提示有T细胞缺陷）；2.做皮肤迟发性超敏反应试验（迟发型皮肤超敏反应试验对2岁以上儿童是有价值的筛查T细胞缺陷的试验）；3.诊断细胞免疫最有价值的
18、先进试验是T细胞和T细胞亚群(辅助/诱导细胞和抑制/细胞毒细胞)的计数4.测量病人淋巴细胞增殖和增大(转化)能力的另一种有效的先进试验5.其他：测细胞因子等等,吞噬细胞缺陷的试验,当病人有确切的免疫缺陷病史而B细胞和T细胞免疫正常时，需检查有无吞噬细胞障碍如四唑氮蓝(NBT)还原试验吞噬作用还可通过计数分离的粒细胞或单核细胞吞噬胶乳粒子或细菌的情况作检测大、小吞噬作用,补体缺陷的试验,补体异常的筛查是测定血清总补体活性(CH50)以及血清C3，C4浓度。发现其中任何一种浓度低下时，必须接着做经典途径和替代途径的补体滴定，和各个补体成分的测定还可用抗血清测定补体调控蛋白；遗传性血管性水肿多伴有C1抑制物缺陷，C3分解代谢过盛的C3缺陷伴有因子(C3抑制物)缺陷。测定血清调理活性，趋化活性或杀菌活性可作为判断补体功能的间接试验。,