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1、分子生物学实验技术,主讲：琚春梅Tel：13380065982兽医学院微生物教研室,第一章RNA的提取和cDNA的合成,RT-PCR原理及应用,应用：基因检测、基因转录产物的分析、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统,一、RNA的提取,RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。,采取的措施：1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2小时以上。3、不能用高温烘烤的材料如塑料容器、试剂等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理
2、，然后高压灭菌以消除残存的DEPC。,注意事项：1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。2、DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT（二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。,总RNA提取方法（试剂盒）：异硫氰酸胍苯酚法（Trizol法）原理：首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽
3、提沉淀RNA，就可以得到纯净的RNA。,二、cDNA的合成,反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶种类：两种1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶包括两个多肽亚基（最适温度42）活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。,2、鼠白血病病毒(MLV)反转录酶只有单个多肽亚基（最适温度37）活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。,cDNA引物种类：1、随机六聚体引物：不
4、特异的引物体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。,2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。,3、特异性引物用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。,第二章聚合酶链式反应（PCR）,一
5、、PCR基本步骤,三个步骤：1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94下解链。2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。3、延伸(Extension)：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度(72左右)下，以目的DNA为模板进行合成。,二、PCR反应中的主要成分,引物：好坏是PCR成败的关键。设计原则：1、引物长度约为16-30bp2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的解链温度Tm4(G+C)+2(A+T)，且接近72最好。3、四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区
6、引发错误。,4、引物3-端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。5、在引物内，尤其在3-端应不存在二级结构，且3-端尽量不用T，尤应避免连续2个或2个以上T，因为T引发错配的几率高。,6、两引物之间尤其在3-端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。7、引物5-端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在5-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。,8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。引物浓度：一般PCR反应中的引物终浓度为0.2
7、-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。,4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200mol/L。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。,Mg2+：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0
8、.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。,在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。模板：PCR中模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。,就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中模板量为102-105个拷贝。扩增单拷贝基因，需要0.1g的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。多拷贝基因扩增用量更少。模板过多可能增加非特异性产物。DNA中的杂
9、质也会影响PCR的效率。,TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5130min，9540min，975min。TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为7430min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为210-4核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。,所用的酶量适当。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。反应结束后，需要灭活TaqDNA聚合酶。灭活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR产物经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(
10、3)99-100加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。,反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/LTrisCl(20下pH8.3-8.8)，50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA)，可稳定酶活性；加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长DNA片段有利。各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。,三、PCR反应参数,变性在第一轮循环前，在94下变性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解链。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的
11、DNA双链会很快复性，减少DNA产量。一般变性温度与时间为941min。,在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。,退火引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。一般当引物中G、C含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。,实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。通常退火温度和时间为37-55，1-2min。退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主
12、要是为使整个反应体系达到合适的温度。,延伸延伸反应通常为72，接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20-85。延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中，TaqDNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。,延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,循环参数一般而言，25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中
13、非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环后，反应中Taq酶已经不足。如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达109-1010。,在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。,四、PCR产物的纯化,酚/氯仿法Kit法,五、PCR产物的克隆,利用T-Vector克隆TaqDNA聚合酶会
14、在3-端加上多余的非模板依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A。利用这一特点，可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT，使载体与PCR产物末端互补并进行连接。,粘性末端连接利用引物中附加在5端的限制酶位点，直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组DNA。如果上、下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点，经酶切后定向克隆到载体中。,第三章DNA酶切及凝胶电泳,一、DNA的限制性内切酶分析,类限制性内切酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段。如，Sma
15、：5-CCCGGG-3,有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端。如，EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5GAATTC35GAATTC33CTTAAG53CTTAAG5,酶切反应单酶切：各种酶缓冲液、反应温度不同如，BamH反应温度为30双酶切：缓冲液不同，反应温度为37。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。酶切时保护碱基的个数,二、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶分离DNA片度
16、大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度200bp至50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。,在电场中，带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由多种因素决定：DNA的分子大小线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。,琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。,DNA分子的构象相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而线状双链
17、DNA移动最慢。电源电压在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。电压增加时，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。,离子强度影响在没有离子时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动。在高离子强度时(如误加10电泳缓冲液配制凝胶)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。,第四章其它工具酶,一、连接酶（连接反应）,类型与用途1、T4DNA连接酶催化相邻DNA链的5-P末端和3-OH末端之间形成磷酸二酯键。它不仅可以催化粘性末端DNA之间的连接，也可以催化平滑末端DNA之间的连接。用途：（1）DNA片断和载体DNA的连接。（2）DNA片断和LinkerDNA的
18、连接。,2、大肠杆菌DNA连接酶催化相邻DNA链的5-P末端和3-OH末端之间形成磷酸二酯键。一般只能催化突出末端DNA之间的连接，如果要催化平滑末端DNA之间的连接反应，需要有PEG及高浓度一价阳离子的存在。用途：（1）DNA片断和载体DNA的连接。（2）DNA片断和LinkerDNA的连接。,连接要求与结果,反应体系（20l）载体DNA1l外源DNA3l10T4DNALigationBuffer2lT4DNALigase1lddH2O13l载体DNA与外源DNA的摩尔比通常为13左右。反应条件：168-14h，通常过夜即可。,二、碱性磷酸酶（去磷酸化反应）,类型：SAP（虾的碱性磷酸酶）、
19、BAP（大肠杆菌C75碱性磷酸酶）、CIAP（小牛肠碱性磷酸酶），其中BAP、CIAP应用最广泛。用途：去除载体DNA5-末端的磷酸基团，防止自身环化反应。,反应体系（50l）载体DNA20l10AlkalinePhosphateBuffer5lAlkalinePhosphatase2lddH2O23l反应条件：5-突出端3730min，对于平末端及5-凹端使用BAP应在5560条件下反应。,三、DNA聚合酶（补平反应）,类型与用途1、KlenowFragment（大肠杆菌DNA聚合酶I大片断）具有53的DNA聚合酶活性，对于单链DNA具有35的外切核酸酶活性，但较弱。用途：双链DNA5-突出
20、端的平滑化。,2、T4DNA聚合酶具有53的DNA聚合酶活性和35的外切核酸酶活性，且后者比KlenowFragment外切核酸酶活性高1001000倍。用途：双链DNA5-突出端和双链DNA3-突出端的平滑化。,反应体系：（20l）DNA5-突出端12l10Buffer2lKlenowFragment1ldNTPs0.5lddH2O4.5l双链DNA3-突出端的平滑化反应不需加dNTPs即可。反应条件：3730min,第五章感受态细胞的制备与转化,受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，它可以容忍外源DNA分子进入其体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，KC
21、l等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。,转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使受体细胞出现新的遗传性状。为了提高转化效率，要考虑几个重要因素：1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。,细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影
22、响转化效率。,2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。,3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌。,第六章质粒DNA的提取,质粒载体的特性,质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传
23、因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的不相容性：利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在。,理想的克隆载体的特性：1、分子量小、多拷贝、松驰控制型2、具有多种常用的限制性内切酶的单切点3、能插入较大的外源DNA片段4、具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。,质粒分离的基本步骤,1、培养细菌使质粒扩增2、收集和裂解细胞采用溶菌酶可
24、破坏菌体细胞壁，SDS和TritonX-100可使细胞膜裂解。经处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。,当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。3、分离和纯化质粒DNA,在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处
25、或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA。如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。,质粒的提取（碱裂解法）,试剂配制：溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4冰箱。溶液：0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释)，1%SDS。,溶液：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Ac5mol/L。酚:氯仿:异
26、戊醇25:24:1RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTrisCl(pH7.5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100加热15分钟，使混有的DNA酶失活。,操作步骤：1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，4下12000g离心30秒。2、弃上清，将eppendorf管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡)，室温下放置5-10分钟。,4、加入新配制的溶液200l，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5分钟。5、加入150l预冷的溶液，盖紧管口，并倒置
27、离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4下12000g离心5-10分钟。,6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，4下12000g离心5分钟。7、将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。,8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml75%乙醇洗沉淀一次，4下12000g离心5-10分钟。9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20lTE缓冲液(pH8.0，含20g/mlRNase)中，储于-20冰箱中。,