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1、分子生物学实验技术第1页，共78页，编辑于2022年，星期五第一章第一章 RNA RNA的提取和的提取和cDNAcDNA的合成的合成第2页，共78页，编辑于2022年，星期五RT-PCRRT-PCR原理及应用原理及应用提取总提取总RNARNA反转录反转录cDNAPCR作模板作模板获得目的基因获得目的基因应用：基因检测、基因转录产物的分析、应用：基因检测、基因转录产物的分析、合成合成cDNA探针、构建探针、构建RNA高效转录系统高效转录系统第3页，共78页，编辑于2022年，星期五一、一、RNARNA的提取的提取pRNARNA易降解，在提取过程中要严格防止易降解，在提取过程中要严格防止RNARN
2、A酶的污染，酶的污染，并设法抑制其活性。并设法抑制其活性。pRNARNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、手指、手指、试剂、容器等。试剂、容器等。第4页，共78页，编辑于2022年，星期五采取的措施：采取的措施：1 1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。一次性手套）。2 2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200200烘烤烘烤2 2小时小时以上。以上。3 3、不能用高温烘烤的材料如塑料容器、试剂等可用、不能用高温烘烤的材料如塑料容器、试剂等可用0
3、.1%0.1%的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯(DEPC)(DEPC)水溶液处理，然后高压水溶液处理，然后高压灭菌以消除残存的灭菌以消除残存的DEPCDEPC。第5页，共78页，编辑于2022年，星期五注意事项：注意事项：1 1、DEPCDEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。与氨水溶液混合会产生致癌物。2 2、DEPCDEPC能与胺和巯基反应，因而含能与胺和巯基反应，因而含TrisTris和和DTTDTT（二硫（二硫苏糖醇）的试剂不能用苏糖醇）的试剂不能用DEPCDEPC处理。处理。3 3、TrisTris溶液可用溶液可用DEPCDEPC处理的水配制然后高压灭菌。处理的水配制然后高压灭菌。4 4、配
4、制的溶液如不能高压灭菌，可用、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPCDEPC处理水配处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。制，并尽可能用未曾开封的试剂。第6页，共78页，编辑于2022年，星期五总总RNA提取方法（试剂盒）：提取方法（试剂盒）：异硫氰酸胍苯酚法（异硫氰酸胍苯酚法（Trizol 法法）原理：原理：首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释放出来的放出来的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH时溶解度不同，时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和
5、水相，从而使分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNADNA和和RNARNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀RNARNA，就可以得到纯净的，就可以得到纯净的RNARNA。第7页，共78页，编辑于2022年，星期五二、二、cDNAcDNA的合成的合成5Buffer4ldNTPs6lRNA酶抑制剂酶抑制剂1lOligo（dT）1l随机引物随机引物1l反转录酶反转录酶AMV1l提取的提取的RNA6l总体积总体积20l第8页，共78页，编辑于2022年，星期五第9页，共78页，编辑于2022年，星期五p反转录酶：依赖于反转录酶：依赖于RNARNA的的DN
6、ADNA聚合酶聚合酶种类：两种种类：两种1、禽类成髓细胞病毒（、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶）反转录酶包括两个多肽亚基（最适温度包括两个多肽亚基（最适温度4242）活性：依赖于活性：依赖于RNARNA的的DNADNA合成，依赖于合成，依赖于DNADNA的的DNADNA合成合成以及对以及对DNA:RNADNA:RNA杂交体的杂交体的RNARNA部分进行内切降解部分进行内切降解(RNA(RNA酶酶H H活性活性)。第10页，共78页，编辑于2022年，星期五2 2、鼠白血病病毒、鼠白血病病毒(MLV)(MLV)反转录酶反转录酶 只有单个多肽亚基（最适温度只有单个多肽亚基（最适温度3737）活
7、性：依赖于活性：依赖于RNARNA和依赖于和依赖于DNADNA的的DNADNA合成活性，但降合成活性，但降解解RNA:DNARNA:DNA杂交体中的杂交体中的RNARNA的能力较弱，且对热的的能力较弱，且对热的稳定性较稳定性较AMVAMV反转录酶差。反转录酶差。MLV MLV反转录酶能合成较长的反转录酶能合成较长的cDNA(cDNA(如大于如大于2-3kb)2-3kb)。第11页，共78页，编辑于2022年，星期五pcDNAcDNA引物引物种类：种类：1 1、随机六聚体引物：不特异的引物随机六聚体引物：不特异的引物 体系中所有体系中所有RNARNA分子全部充当了分子全部充当了cDNAcDNA第
8、一链模板，第一链模板，PCRPCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的用此引物合成的cDNAcDNA中中96%96%来源于来源于rRNArRNA。第12页，共78页，编辑于2022年，星期五2 2、Oligo(dT)Oligo(dT)：是一种对：是一种对mRNAmRNA特异的引物特异的引物绝大多数真核细胞绝大多数真核细胞mRNAmRNA具有具有3 3端端Poly(A+)Poly(A+)尾，此引尾，此引物（物（12-1812-18核苷酸）与其配对，仅核苷酸）与其配对，仅mRNAmRNA可被反转录。可被反转录。由于由于Poly(A+)RNA
9、Poly(A+)RNA仅占总仅占总RNARNA的的1-4%1-4%，故此种引物合成，故此种引物合成的的cDNAcDNA比随机六聚体引物得到的比随机六聚体引物得到的cDNAcDNA在数量和复杂在数量和复杂性方面均要小。性方面均要小。第13页，共78页，编辑于2022年，星期五3 3、特异性引物特异性引物 用含目标用含目标RNARNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的此类引物仅产生所需要的cDNAcDNA，导致更为特异的，导致更为特异的PCRPCR扩增。扩增。第14页，共78页，编辑于2022年，星期五第二章第二章 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应
10、（PCR）第15页，共78页，编辑于2022年，星期五一、一、PCRPCR基本步骤基本步骤三个步骤：三个步骤：1 1、变性、变性(Denature)(Denature)：双链：双链DNADNA目的片段在目的片段在9494下解链。下解链。2 2、退火、退火(Anneal)(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度：两种寡核苷酸引物在适当温度(50(50左右左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。下与模板上的目的序列通过氢键配对。3 3、延伸、延伸(Extension)(Extension)：在：在Taq DNATaq DNA聚合酶合成聚合酶合成DNADNA的最适的最适温度温度(72(72左右左
11、右)下，以目的下，以目的DNADNA为模板进行合成。为模板进行合成。第16页，共78页，编辑于2022年，星期五第17页，共78页，编辑于2022年，星期五二、二、PCRPCR反应中的主要成分反应中的主要成分ddH2O32.7l10PCR Buffer5ldNTPs4lP12lP22lTaq0.3lcDNA template4lTotal50l第18页，共78页，编辑于2022年，星期五p引物：好坏是引物：好坏是PCRPCR成败的关键。成败的关键。设计原则：设计原则：1 1、引物长度约为、引物长度约为16-30bp16-30bp 2 2、引物中、引物中G+CG+C含量通常为含量通常为40%-6
12、0%40%-60%，粗略估计引物的，粗略估计引物的解链温度解链温度TmTm4(G+C)+2(A+T)4(G+C)+2(A+T)，且接近，且接近7272最好。最好。3 3、四种碱基应随机分布，在、四种碱基应随机分布，在33端不存在连续端不存在连续3 3个个G G或或C C，因这样会使引物在，因这样会使引物在G+CG+C富集序列区引发错误。富集序列区引发错误。第19页，共78页，编辑于2022年，星期五4 4、引物、引物3 3-端最好与目的序列阅读框架中密码子第端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。产生的
13、不配对。5 5、在引物内，尤其在、在引物内，尤其在3 3-端应不存在二级结构，且端应不存在二级结构，且3 3-端尽量不用端尽量不用T T，尤应避免连续，尤应避免连续2 2个或个或2 2个以上个以上T T，因为，因为T T引发错配的几率高。引发错配的几率高。第20页，共78页，编辑于2022年，星期五6 6、两引物之间尤其在、两引物之间尤其在3 3-端不能互补，以防出现引端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4 4个连个连续碱基的同源性或互补性。续碱基的同源性或互补性。7 7、引物、引物5-5-端对扩增特异性影响不大，可在引物设端对扩增
14、特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在码子、缺失或插入突变位点等，通常应在5-5-端限端限制酶位点外再加制酶位点外再加1-21-2个保护碱基。个保护碱基。第21页，共78页，编辑于2022年，星期五8 8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。引物不与模板结合位点以外的序列互补。引物浓度：引物浓度：一般一般PCRPCR反应中的引物终浓度为反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，
15、过低则降低产量。则降低产量。第22页，共78页，编辑于2022年，星期五p4 4种三磷酸脱氧核苷酸种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)：dNTPdNTP原液一般配成原液一般配成2.5-10mmol/L2.5-10mmol/L分装，分装，-20-20贮存贮存。一般反应中每种一般反应中每种dNTPdNTP的终浓度为的终浓度为20-200mol/L20-200mol/L。p当当dNTPdNTP终浓度大于终浓度大于50mmol/L50mmol/L时可抑制时可抑制Taq DNATaq DNA聚合聚合酶的活性。酶的活性。p4 4种种dNTPdNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种的浓度应该相等，
16、以减少合成中由于某种dNTPdNTP的不足出现的错误掺入。的不足出现的错误掺入。第23页，共78页，编辑于2022年，星期五pMgMg2+2+：MgMg2+2+浓度对浓度对Taq DNATaq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常通常MgMg2+2+浓度范围为浓度范围为0.5-2mmol/L0.5-2mmol/L。对于一种新的。对于一种新的PCRPCR反应，可以用反应，可以用0.1-5mmol/L0.1-5mm
17、ol/L的递增浓度的的递增浓度的MgMg2+2+进进行预备实验，选出最适的行预备实验，选出最适的Mg2+Mg2+浓度。浓度。第24页，共78页，编辑于2022年，星期五在在PCRPCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或电荷的基团，例如磷酸基团或EDTAEDTA等可能影响等可能影响MgMg2+2+浓度的物质，以保证最适浓度的物质，以保证最适MgMg2+2+浓度。浓度。p模板：模板：PCRPCR中模板中模板DNADNA可以是单链分子，也可以是双链分可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子子，可以是线状分子
18、，也可以是环状分子(线状分线状分子比环状分子的扩增效果稍好子比环状分子的扩增效果稍好)。第25页，共78页，编辑于2022年，星期五就模板就模板DNADNA而言，影响而言，影响PCRPCR的主要因素是模板的数量的主要因素是模板的数量和纯度。和纯度。一般反应中模板量为一般反应中模板量为10102 2-10-105 5个拷贝。扩增单拷贝基个拷贝。扩增单拷贝基因，需要因，需要0.1g0.1g的人基因组的人基因组DNADNA，10ng10ng的酵母的酵母DNADNA，1ng1ng的大肠杆菌的大肠杆菌DNADNA。多拷贝基因扩增用量更少。多拷贝基因扩增用量更少。模板过多可能增加非特异性产物。模板过多可能
19、增加非特异性产物。DNADNA中的杂质也中的杂质也会影响会影响PCRPCR的效率。的效率。第26页，共78页，编辑于2022年，星期五pTaq DNATaq DNA聚合酶：聚合酶：一般一般Taq DNATaq DNA聚合酶活性半衰期为聚合酶活性半衰期为92.5 130min92.5 130min，95 40min95 40min，97 5min 97 5min。Taq DNATaq DNA聚合酶的酶活性单位定义为聚合酶的酶活性单位定义为74 30min74 30min，掺入掺入10nmol/L dNTP10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。到核酸中所需的酶量。Taq DNATaq DN
20、A聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般般PCRPCR中出错率为中出错率为210210-4-4核苷酸核苷酸/每轮循环，在利用每轮循环，在利用PCRPCR克隆和进行序列分析时尤应注意。克隆和进行序列分析时尤应注意。第27页，共78页，编辑于2022年，星期五所用的酶量适当。所用的酶量适当。酶量过多会使产物非特异性增酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。加，过少则使产量降低。反应结束后，需要灭活反应结束后，需要灭活Taq DNATaq DNA聚合酶。聚合酶。灭活灭活Taq DNATaq DNA聚合酶的方法有：聚合酶的方法有：(1)PCR(1)PCR产物
21、经酚产物经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。氯仿抽提，乙醇沉淀。(2)(2)加入加入10mmol/L10mmol/L的的EDTAEDTA螯合螯合MgMg2+2+。(3)99-100(3)99-100加热加热10min10min。目前已有。目前已有直接纯化直接纯化PCRPCR产物的产物的KitKit可用。可用。第28页，共78页，编辑于2022年，星期五p反应缓冲液：反应缓冲液：反应缓冲液一般含反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris10-50mmol/L TrisCl(20Cl(20下下pH8.3-8.8)pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl50mmol/L KCl和适当浓度的和适当浓
22、度的MgMg2+2+。50mmol/L50mmol/L的的KClKCl有利于引物的退火。有利于引物的退火。加入加入5mmol/L5mmol/L的二硫苏糖醇的二硫苏糖醇(DTT)(DTT)或或100g/ml100g/ml的牛血的牛血清白蛋白清白蛋白(BSA)(BSA)，可稳定酶活性；加入，可稳定酶活性；加入T4T4噬菌体的基噬菌体的基因因3232蛋白对扩增较长蛋白对扩增较长DNADNA片段有利。片段有利。各种各种Taq DNATaq DNA聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。第29页，共78页，编辑于2022年，星期五三、三、PCRPCR反应参数反应参数预变性预变性9
23、4 5min变性变性退火退火延伸延伸94507230s45s1min30cycles终延伸终延伸7210min第30页，共78页，编辑于2022年，星期五p变性变性在第一轮循环前，在在第一轮循环前，在9494下变性下变性5-10min5-10min非常重要，非常重要，它可使模板它可使模板DNADNA完全解链。完全解链。变性不完全，往往使变性不完全，往往使PCRPCR失败，因为未变性完全的失败，因为未变性完全的DNADNA双链会很快复性，减少双链会很快复性，减少DNADNA产量。产量。一般变性温度与时间为一般变性温度与时间为94 1min94 1min。第31页，共78页，编辑于2022年，星期
24、五在变性温度下，双链在变性温度下，双链DNADNA解链只需几秒钟即可完全，解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。度。对于富含对于富含GCGC的序列，可适当提高变性温度。但变的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。第32页，共78页，编辑于2022年，星期五p退火退火引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。
25、以及引物的浓度。一般当引物中一般当引物中G G、C C含量高，长度长并与模板完全含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。产物的特异性越高。第33页，共78页，编辑于2022年，星期五实际使用的退火温度比扩增引物的实际使用的退火温度比扩增引物的TmTm值约低值约低55。通常退火温度和时间为通常退火温度和时间为37-5537-55，1-2min1-2min。退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。主要是为使整个反应体系达到合适的温
26、度。第34页，共78页，编辑于2022年，星期五p延伸延伸延伸反应通常为延伸反应通常为7272，接近于，接近于Taq DNATaq DNA聚合酶的最聚合酶的最适反应温度适反应温度7575。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq Taq DNADNA聚合酶的作用温度范围可从聚合酶的作用温度范围可从20-8520-85。延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中，在一般反应体系中，Taq DNATaq DNA聚合酶每分钟约可合聚合酶每分钟约可合成成2kb2kb长的长的DNADNA。第35页，共78
27、页，编辑于2022年，星期五延伸时间过长会导致产物非特异性增加。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间(10-30min)(10-30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的产的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。第36页，共78页，编辑于2022年，星期五p循环参数循环参数p一般而言，一般而言，25-3025-30轮循环已经足够。循环次数过多
28、，轮循环已经足够。循环次数过多，会使会使PCRPCR产物中非特异性产物大量增加。产物中非特异性产物大量增加。p通常经通常经25-3025-30轮循环后，反应中轮循环后，反应中TaqTaq酶已经不足。酶已经不足。p如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的增的DNADNA样品稀释样品稀释10103 3-10-105 5倍作为模板，重新加入各倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经种反应底物进行扩增，这样经6060轮循环后，扩增水轮循环后，扩增水平可达平可达10109 9-10-101010。第37页，共78页，编辑于2022年，星期五在扩
29、增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。应，减少非特异性产物。第38页，共78页，编辑于2022年，星期五四、四、PCRPCR产物的纯化产物的纯化p酚酚/氯仿法氯仿法pK
30、it法法酚酚:氯仿氯仿:异戊醇抽提异戊醇抽提2 2次次 PCRPCR产物产物加加TE100TE100l混匀混匀回收水相回收水相沉淀沉淀DNADNA无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀纯化纯化DNADNA75乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀ddH2O ddH2O 溶解溶解DNADNA第39页，共78页，编辑于2022年，星期五五、五、PCRPCR产物的克隆产物的克隆p利用利用T-VectorT-Vector克隆克隆Taq DNATaq DNA聚合酶会在聚合酶会在3 3-端加上多余的非模板依赖端加上多余的非模板依赖碱基，而且对碱基，而且对A A优先聚合，所以优先聚合，所以PCRPCR产物末端的多产物末端的多余碱基大部
31、分都是余碱基大部分都是A A。利用这一特点，可以经限制酶切割产生的平末端利用这一特点，可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上用酶加上dTdT或或ddTddT，使载体与，使载体与PCRPCR产物末端互补并产物末端互补并进行连接。进行连接。第40页，共78页，编辑于2022年，星期五p粘性末端连接粘性末端连接 利用引物中附加在利用引物中附加在5 5端的限制酶位点，直接将端的限制酶位点，直接将PCRPCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组载体连接，产生重组DNADNA。如果上、下游两个引物中含有两个不同的限制酶如果上、下游两个引物中含有两
32、个不同的限制酶位点，经酶切后定向克隆到载体中。位点，经酶切后定向克隆到载体中。第41页，共78页，编辑于2022年，星期五第三章第三章 DNADNA酶切及凝胶电泳酶切及凝胶电泳 第42页，共78页，编辑于2022年，星期五一、一、DNADNA的限制性内切酶分析的限制性内切酶分析p类限制性内切酶类限制性内切酶p识别长度为识别长度为4 4至至6 6个核苷酸的回文对称特异核苷酸个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。序列。p类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的切割，产生平末端的DNADNA片段。片段。如，如，SmaSma：5 5-CCCGGG-
33、3-CCCGGG-3第43页，共78页，编辑于2022年，星期五有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的末端的DNADNA片段称粘性未端。片段称粘性未端。如，如，EcoREcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。末端。5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5第44页，共78页，编辑于2022年，星期五p酶切反应酶切反应p单酶切：各种酶缓冲液、反应温度不同单酶切：各种酶缓冲液、反应温度不同 如，如，BamH反应温度为反应温度为3030p双酶切：缓冲液不同，反应温度为双酶切
34、：缓冲液不同，反应温度为3737。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。度的限制性内切酶水解。p酶切时保护碱基的个数酶切时保护碱基的个数第45页，共78页，编辑于2022年，星期五二、琼脂糖凝胶电泳二、琼脂糖凝胶电泳p琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖主要在主要在DNADNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。密度取决于琼脂糖的浓度。p
35、琼脂糖凝胶分离琼脂糖凝胶分离DNADNA片度大小范围较广，不同浓度片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度琼脂糖凝胶可分离长度200bp200bp至至50kb50kb的的DNADNA片段。片段。p琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。电泳。第46页，共78页，编辑于2022年，星期五p在电场中，带负电荷的在电场中，带负电荷的DNADNA向阳极迁移，其迁移速向阳极迁移，其迁移速率由多种因素决定：率由多种因素决定：pDNADNA的分子大小的分子大小 线状双链线状双链DNADNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的
36、迁移速率与速率与DNADNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。得越慢。第47页，共78页，编辑于2022年，星期五琼脂糖浓度琼脂糖浓度 一个给定大小的线状一个给定大小的线状DNADNA分子，其迁移速度在不同浓度的分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。琼脂糖凝胶中各不相同。DNADNA电泳迁移率的对数与凝胶浓电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。度成线性关系。DNA大小大小凝胶浓度凝胶浓度0.5kb1.21.50.5kb 10kb0.81.010kb0.30.
37、7第48页，共78页，编辑于2022年，星期五DNADNA分子的构象分子的构象 相同分子量的线状、开环和超螺旋相同分子量的线状、开环和超螺旋DNADNA在琼脂糖凝在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNADNA移动最快，移动最快，而线状双链而线状双链DNADNA移动最慢。移动最慢。电源电压电源电压 在低电压时，线状在低电压时，线状DNADNA片段的迁移速率与所加电压片段的迁移速率与所加电压成正比。电压增加时，琼脂糖凝胶的有效分离范成正比。电压增加时，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。围将缩小。第49页，共78页，编辑于2022年，星期五离子强度影响离子强度影响
38、在没有离子时在没有离子时(如误用蒸馏水配制凝胶如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率，电导率最小，最小，DNADNA几乎不移动。几乎不移动。在高离子强度时在高离子强度时(如误加如误加1010电泳缓冲液配制凝胶电泳缓冲液配制凝胶)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或化或DNADNA变性。变性。第50页，共78页，编辑于2022年，星期五第四章第四章 其它工具酶其它工具酶第51页，共78页，编辑于2022年，星期五一、连接酶（连接反应）一、连接酶（连接反应）p类型与用途类型与用途1 1、T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶p催化相邻催化相邻DNADNA链
39、的链的5 5-P-P末端和末端和3 3-OH-OH末端之间形末端之间形成磷酸二酯键。它不仅可以催化粘性末端成磷酸二酯键。它不仅可以催化粘性末端DNADNA之之间的连接，也可以催化平滑末端间的连接，也可以催化平滑末端DNADNA之间的连接。之间的连接。p用途：（用途：（1 1）DNADNA片断和载体片断和载体DNADNA的连接。的连接。（2 2）DNADNA片断和片断和Linker DNALinker DNA的连接。的连接。第52页，共78页，编辑于2022年，星期五2 2、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶 催化相邻催化相邻DNADNA链的链的5 5-P-P末端和末端和3 3-OH-O
40、H末端之间形末端之间形成磷酸二酯键。一般只能催化突出末端成磷酸二酯键。一般只能催化突出末端DNADNA之间的之间的连接，如果要催化平滑末端连接，如果要催化平滑末端DNADNA之间的连接反应，之间的连接反应，需要有需要有PEGPEG及高浓度一价阳离子的存在。及高浓度一价阳离子的存在。用途：（用途：（1 1）DNADNA片断和载体片断和载体DNADNA的连接。的连接。（2 2）DNADNA片断和片断和Linker DNALinker DNA的连接。的连接。第53页，共78页，编辑于2022年，星期五p连接要求与结果连接要求与结果外源外源DNADNA片段末端性质片段末端性质连接要求连接要求连接结果连
41、接结果不对称粘性末端不对称粘性末端两种限制酶消两种限制酶消化后，需纯化化后，需纯化载体以提高连载体以提高连接效率接效率载体与外源载体与外源DNADNA连接处的限制酶切位点常连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNADNA可以定向插入到载体中。可以定向插入到载体中。对称性粘性末端对称性粘性末端线形载体线形载体DNADNA常需磷酸酶去常需磷酸酶去磷酸化处理磷酸化处理载体与外源载体与外源DNADNA连接处的限制酶切位点常连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源可保留；重组质粒会带有外源DNADNA的串联的串联拷贝；外源拷贝；外源DNADN
42、A会以两个方向插入到载体会以两个方向插入到载体中。中。平端平端要求高浓度的要求高浓度的DNADNA和连接酶和连接酶载体与外源载体与外源DNADNA连接处的限制酶切位点可连接处的限制酶切位点可能消失；重组质粒会带有外源能消失；重组质粒会带有外源DNADNA的串联的串联拷贝；非重组克隆的背景较高拷贝；非重组克隆的背景较高 。第54页，共78页，编辑于2022年，星期五p反应体系（反应体系（20l）载体载体DNA 1l外源外源DNA 3l10T4 DNA Ligation Buffer 2lT4 DNA Ligase 1lddH2O 13l载体载体DNADNA与外源与外源DNADNA的摩尔比通常为的
43、摩尔比通常为1 13 3左右。左右。反应条件：反应条件：16 8-14h16 8-14h，通常过夜即可。，通常过夜即可。第55页，共78页，编辑于2022年，星期五二、碱性磷酸酶（去磷酸化反应）二、碱性磷酸酶（去磷酸化反应）p类型：类型：SAP SAP（虾的碱性磷酸酶）、（虾的碱性磷酸酶）、BAPBAP（大肠杆菌（大肠杆菌C75C75碱碱性磷酸酶）、性磷酸酶）、CIAPCIAP（小牛肠碱性磷酸酶），其中（小牛肠碱性磷酸酶），其中BAPBAP、CIAPCIAP应用最广泛。应用最广泛。p用途：用途：去除载体去除载体DNA 5DNA 5-末端的磷酸基团，防止自身环末端的磷酸基团，防止自身环化反应。化
44、反应。第56页，共78页，编辑于2022年，星期五p反应体系（反应体系（50l l ）载体载体DNA 20l10Alkaline Phosphate Buffer 5lAlkaline Phosphatase 2lddH2O 23l反应条件：反应条件：5-突出端突出端37 30min，对于平末端及，对于平末端及5-凹端使用凹端使用BAP 应在应在5560条件下反应。条件下反应。第57页，共78页，编辑于2022年，星期五三、三、DNADNA聚合酶（补平反应）聚合酶（补平反应）p类型与用途类型与用途1 1、Klenow FragmentKlenow Fragment（大肠杆菌（大肠杆菌DNADN
45、A聚合酶聚合酶I I大片断）大片断）具有具有5 533的的DNADNA聚合酶活性，对于单链聚合酶活性，对于单链DNADNA具有具有3 355的外切核酸酶活性，但较弱。的外切核酸酶活性，但较弱。用途：双链用途：双链DNA5DNA5-突出端的平滑化。突出端的平滑化。第58页，共78页，编辑于2022年，星期五2 2、T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶具有具有5 533的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3 355的外切核的外切核酸酶活性，且后者比酸酶活性，且后者比Klenow FragmentKlenow Fragment外切核酸酶外切核酸酶活性高活性高10010010001000倍。倍。用
46、途：双链用途：双链DNA5DNA5-突出端和双链突出端和双链DNA3DNA3-突出端的突出端的平滑化。平滑化。第59页，共78页，编辑于2022年，星期五p反应体系：（反应体系：（2020l l）DNA 5-突出端突出端 12l10Buffer 2lKlenow Fragment 1ldNTPs 0.5lddH2O 4.5l双链双链DNA3DNA3-突出端的平滑化反应不需加突出端的平滑化反应不需加dNTPsdNTPs即可。即可。反应条件：反应条件：37 30min37 30min 第60页，共78页，编辑于2022年，星期五第五章第五章 感受态细胞的制备与转化感受态细胞的制备与转化第61页，共
47、78页，编辑于2022年，星期五p受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，它受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，它可以容忍外源可以容忍外源DNADNA分子进入其体内并稳定地遗传给分子进入其体内并稳定地遗传给后代。后代。p受体细胞经过一些特殊方法受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，如电击法，CaClCaCl2 2，KClKCl等化学试剂法等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源生了暂时性的改变，成为能允许外源DNADNA分子进入分子进入的感受态细胞的感受态细胞(Compenent cells)(Compenent cells)。第62
48、页，共78页，编辑于2022年，星期五p转化转化(Transformation)(Transformation)是将外源是将外源DNADNA分子引入受体分子引入受体细胞，使受体细胞出现新的遗传性状。细胞，使受体细胞出现新的遗传性状。p为了提高转化效率，要考虑几个重要因素：为了提高转化效率，要考虑几个重要因素：1 1、细胞生长状态和密度：细胞生长状态和密度：p不要用经过多次转接或储于不要用经过多次转接或储于44的培养菌，最好从的培养菌，最好从7070或或-20-20甘油保存的菌种中直接转接用于制甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。备感受态细胞的菌液。第63页，共78页，编辑于202
49、2年，星期五细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的过监测培养液的OD600 OD600 来控制。来控制。DH5DH5菌株的菌株的OD600 OD600 为为0.50.5时，细胞密度在时，细胞密度在5105107 7 个个/ml/ml左右左右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同)，这时比较，这时比较合适。合适。密度过高或不足均会影响转化效率。密度过高或不足均会影响转化效率。第64页，共78页，编辑于2022年，星期五2 2、质粒的质量和浓度：质粒的质量和浓度：用于转化的质粒用于转化的质粒DNADNA应主要是超螺旋态应主要是超螺
50、旋态DNADNA。转化效率与外源转化效率与外源DNADNA的浓度在一定范围内成正比，的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源但当加入的外源DNADNA的量过多或体积过大时，转化的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。效率就会降低。一般情况下，一般情况下，DNADNA溶液的体积不应超过感受态细胞溶液的体积不应超过感受态细胞体积的体积的5%5%。第65页，共78页，编辑于2022年，星期五3 3、试剂的质量：试剂的质量：所用的试剂，如所用的试剂，如CaCl2 CaCl2 等均需是最高纯度的等均需是最高纯度的(GR.(GR.或或AR.)AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥，并用超纯水配制，最