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1、造血细胞分离、集落培养及表型分析造血细胞分离、集落培养及表型分析所谓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。图 1 造血系统和造血干细胞分化图Fig。 1 hematopoietic system and hematopoietic stem celldifferentiation.造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和
2、动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落
3、形成单位（multipotent colony-forming units，CFU-GEMM或 mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14 天，然后在显微镜下计数集落。造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。此外，1997 年发现一个新的造血干细胞标志是 AC133，但具 CD34 抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。一、实验原理1、用流式细胞仪分析细胞表型待测细胞
4、被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交。该区称为测量区。利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反
5、转换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。2、单个核细胞的分离采用密度梯度原理，利用血液中各类细胞的密度不同进行分离。3、CD34+细胞分选利用抗原抗体反应的原理，样品中的 CD34+细胞可与偶联有 CD34 抗原的磁珠反应，将 MiniMACS 免疫磁性吸附柱置于磁场中，未与磁珠结合的 CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的 CD34细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS 缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的 CD34细胞。4、集落检测利用造血干细胞的特性，在特定的条件下，造血干细胞可向某一系的细胞分化，从而在半
6、固体培养基上形成一个个的克隆，即集落，一个集落代表一个造血干/祖细胞。二、实验材料脐血脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。供者要求身体健康，发育良好的非高龄产妇。无遗传病史，无病毒病史，无血液系统疾病，无寄生虫病及地方病。HIV、肝炎、梅毒等检测均为阴性。健康产妇分娩以后，立即用血袋无菌采取新生儿脐带血，血袋内装有无菌 ACDB25mL 抗凝剂(每 100mLACDB 含有：一水合枸橼酸 0.48g，二水合枸橼酸钠 1.32g，一水合葡萄糖 1.47g)，相当于 100mL 的血液抗凝剂，每次实际采集脐带血 50-100mL。采集后脐带血置于 4冰箱内保存，一般在6 小时内取回分离。培养基与细胞
7、因子培养基为 IMDM 培养基，添加 20%的胎牛血清。细胞因子均为人重组蛋白，干细胞因子（SCF）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-3（IL-3）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素（EPO）、三、实验方法单个核细胞的 Ficoll 密度梯度离心分离将脐血用 IMDM 培养基以 1：2 稀释，在 50mL 离心管中加入 15mL Ficoll，之后小心加入 30mL 稀释的脐血平铺在 Ficoll 上，之后置于吊篮式离心机中在 400g下密度梯度离心 30min，吸取中间的白层，用 IMDM 培养基洗涤细胞，除去淋巴细胞分离液
8、和血小板。集落分析方法CFUGM 的检测体系为 IMDM 培养基，添加 20胎牛血清，4mmol/mL 谷氨酰胺，含 0.9甲基纤维素，以及人重组造血生长因子 SCF、IL-3、IL-6，GMCSF、GCSF,其浓度分别为 50 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL 和 20ng/mL。半固体培养在 24 孔板中进行，每孔加半固体培养基 500L，加入 2.5104 个单个核细胞。在 37、5CO2、湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养 14 天后在显微镜下进行集落计数，超过 50 个细胞的细胞簇为一个集落。流式细胞分析取 1.0106 细胞用 PBS 洗两遍，重悬后分配
9、到 1.5mL 管中离心，加 PE 偶联的小鼠抗人 CD34 单抗和 FITC 偶联的小鼠抗人 CD45 单抗各 10L，4孵育 30 分钟。PBS 洗两遍，离心后，每管加 1mL FACS 保存液。同型对照以 PE 偶联的小鼠抗真菌毒素标记。标记细胞用流式细胞仪（BD 公司）分析，结果用 Lysis II 软件处理，以 CD45 设门进行分析。脐血 CD34细胞的分离纯化将 1.0108 细胞悬浮于 0.3mlMACS 缓冲液中，加 50l 偶联于磁珠的小鼠抗人 CD34+抗体，4孵育 30 分钟，采用 MiniMACS 免疫磁性吸附柱分离装置洗涤吸附柱中进行分离，未与磁珠结合的 CD34-
10、细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的 CD34细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用 MACS 缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的 CD34细胞。四、实验结果1、单个核细胞的分离脐血的体 脐血中单个核细胞分离出的单个核细胞液的 分离出的单个核细胞液 收积液体积密度2.5样品 2孔内接种的单个核细胞 孔内的集落 每 10000 个细胞中集落数目样品2.51样品2.52样品 1CD34+细胞的比例一袋脐血中 CD34+细胞的总数数43的数目一袋脐血中总集落数1.2540ml的体积40ml率样品 12、造血干/祖细胞集落计数313、脐血中 CD34+细胞的数量样品 2样品 1样品 24、脐血中分离得到的 CD
11、34+细胞的数量CD34+细胞的数目五、讨论1、从一袋血获得的 CD34+细胞数与集落形成数之间有和关联？2、用 MiniMACS 免疫磁性吸附柱分离法获得的 CD34+细胞数，与流式细胞分析的结果是否一致？若不一致，原因何在？动物细胞培养、计数、冷冻和复苏. 动物细胞的培养和计数一、 实验目的由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体
12、等。另外，目前方兴未艾的组织工程、干细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是细胞工程、组织工程等研究领域的基础。本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项；用血球计数板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。二、 基本原理动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程
13、，这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养 1050 代左右即退化死亡；由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。动物细胞培养与微生物培养有很大不同，这主要是因为动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体表面才能生长。虽然动物细胞培养的基本原理和微生物类似，但动物细胞对于营养的要求更加苛刻，除氨基酸、维生素盐类、葡萄糖外，通常还需要血清；对
14、于培养环境的适应性也比微生物差，其对环境极其敏感，包括 pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培养过程中一般需严格监控；动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长，它们对环境的影响又比微生物大，因此常用空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合气体进行供氧和调节 pH。动物细胞培养还需要防治污染问题，细菌、真菌、病毒或细胞均可导致动物细胞培养的污染，而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境都有可能含有污染物。因为动物细胞的培养周期通常为数天到数周，培养时间较长，因此防治污染问题则更加显得重要。细胞培养过程中需要对细胞生长状态进行监测，这就必须在培养过程中随时取样进行细胞计数。最简单、
15、直接和最经济的方法是用血球计数板计数。计数时取血球计数板四角的四个大方格，每个方格面积为 1.0mm2，点样后其厚度为 0.1mm，这样每个方格的体积即为 1.010-4ml，细胞数的计算公式为：四个大方格总细胞数稀释倍数1044，单位是细胞数/mL。细胞存活率或称细胞活性的检测是用台盼蓝染色方法，其原理是活细胞的细胞膜完整，染色剂不能渗入，因而不能被染色，而死细胞的细胞膜不完整，细胞被染上蓝色，存活率为：活细胞数总细胞数100。三、 仪器、材料和试剂1. 超净工作台2. 倒置显微镜3. 二氧化碳培养箱：设定二氧化碳浓度为 5。4. 培养基：DMEM 培养基，除菌过滤；自制无血清培养基，0.22m 滤膜除菌过滤。