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1、大豆蛋白质含量的测定实验方案大豆蛋白质含量的测定实验方案1 1 原理原理试样在催化剂存在下用硫酸消解,反应产物用碱中和后蒸馏。释放出的氨被硼酸溶液吸收,吸收液用硫酸溶液滴定,测定氮含量并计算粗蛋白质含量。2 2 试剂试剂除参考物质外,只使用经确认无氮的分析纯试剂 ,试验用水为蒸馏水或去离子水或同等纯度水.警告警告:2.4:2.4、2.82.8、2.ll2.ll 和和 2.12 2.12 中提到的试剂应谨慎使用中提到的试剂应谨慎使用 。2.1 硫酸钾 (K2SO4)。2.2 五水硫酸铜 (CuSO45H20)。2.3 二氧化钛 (TiO2)。2.4 硫酸(H2SO4 ):c(H2SO4)=18m
2、ol/L, 20(H2SO4 )=1.84g/mL。2.5 石蜡油 。2.6 N-乙酰苯胺 (C8H9NO):熔点 114,氮含量 10.36g/100g。2.7 色氨酸(C11H12N202):熔点 282,氮含量 13.72g/100g。2.8 五氧化二磷(P205)。2.9 硼酸:水溶液 , 20(H3BO3)=40g/L,或所使用仪器推荐的浓度。2.10 指示剂:按照所使用仪器的推荐,加入一定体积的溶液 A(2.10.1）和溶液 B(2.10.2 )(例如:5 体积溶液 A 和 1 体积溶液 B)。注 1:有可能准各使用的硼酸溶液中含有指示剂（2.9+2.10） 。注 2:溶液 A 和
3、溶液 B 的比例可根据仪器进行调整。也可以使用 pH 电极进行电位滴定，PH 电极需要每天校准。5.10.1 溶液 A:200mg 溴甲酚绿（C21H14Br4O5S）溶于体积分数为 95%的乙醇（C2H5OH） ，配制成 100mL 溶液。5.10.2 溶液 B:200mg 甲基红 （C15H15N3O2） 溶于体积分数为 95%的乙醇 （C2H5OH） ,配制成 100mL 溶液。5.11 氢氧化钠水溶液（NaOH）:质量分数 33%或 40%，含氮量少于或等于0.001%。也可以使用含氮量少于或等于 0.001%的工业级氢氧化钠。5.12 硫酸:标准滴定溶液，c（H2SO4）=0.05m
4、ol/L因为硫酸在连接管中不产生气泡，所以推荐用硫酸代替盐酸。5.13 硫酸铵：标准滴定溶液 c（NH4）2SO4=0.05mol/L。也可以选择使用某一种盐，例如（NH4）2Fe（SO4）26H20。5.14 浮石:颗粒状，盐酸酸洗并灼烧。5.15 蔗糖(可选择） ：不含氮。3 3 仪器仪器3.1 机械研磨机。3.2 筛子:孔径 0.8mm。3,.3 分析天平:分度值为 0.001g。3.4 消化、蒸馏和滴定仪器：消化单元应确保温度的均匀性。通过使用两种参考物质(2.6 或 2.7)中任意一种进行全过程测定来评估温度的均匀性，并同时并同时测定回收率。蒸馏仪器也应通过进行已知量铵盐的蒸馏例如
5、10mL 硫酸铵溶液（2.13）和检查回收率,回收率应大于或等于 99.8%。4 4 扦样扦样实验室接受的样品应具有代表性 ,在运输或储藏过程中不应受损或改变。本标准不规定扦样方法,推荐 ISO6644 和 ISO13690 给出的扦样方法。5 5 试样制备试样制备如果需要,样品要进行研磨 ,使其完全通过 0.8mm 孔径的筛子。对于粮食,至少要研磨 200g 样品,研磨后的样品要充分混匀。6 6 水分测定水分测定用本标准第 8 章制备的部分样品测定水分(WH)。测定水分的方法要适合测定对象(例如谷物和谷物制品按 GB/T 21305 测定;玉米按 GB/T 10362 测定。或者使用参考文献
6、10中描述的适合特殊种子的方法)。7 7 操作步骤操作步骤7.1 通则如果需要检查是否满足重复性限(9.2)的 要求 ,可按照 7.2 到 7.5 的步骤迸行两次独立的测定。7.2 称样依据预估含氮量称量试样 (第 8 章),精确到 0.001g,使试样的含氮量在0.005g0.2g 之间,最好大于 0 .02 g。7.3 测定7.31 消化警告警告: :下列操作应在通风良好下列操作应在通风良好, ,具有硫酸防护罩的条仵下进行。具有硫酸防护罩的条仵下进行。转移试样(7.2)到消解烧瓶,然后加人 :10g 硫酸钾(2.1) ;0.30g 五水硫酸铜(2.2);0.30g 二氧化钛(2.3)(也可
7、以使用符合规定成分的粒状催化剂);20mL 硫酸(2.4)。可根据仪器情况调整硫酸的加人量,但应确认此改进可以满足对 N-乙酰胺的回收率达到 99.5%和对色氨酸的回收率达到 99.0%。小心混合以确保试样的完全浸润。 将烧瓶置于顶热到 420 10的消化单元。从消化单元温度再次达到 420 10 时开始计时,至少消化 2h,然后取下自然冷却。注:建议加人浮石(2.14)作为沸腾调节器和加入如石蜡油(2.5)的消泡剂。最短消化时间应使用参考物质进行检验,因为参考物质很难达到回收率的要求(见 7.5)。遵循设备制造商关于蒸汽排空的建议,因为过强的吸力可能导致氮的损失。7.3.2 蒸馏小心地向冷却
8、后的消解烧瓶中加入50mL水,放冷至室温。 量取50mL硼酸(2.9)到接收瓶中 ,无论是使用目测比色或光学探头 ,均要向其中加至10 滴指示剂(2.10)。连接好蒸馏装置,向消解烧瓶中加入 5mL 过量的氢氧化钠溶液完全中和所使用的硫酸,然后开始蒸馏。根据仪器,所用的试剂量可以变化。7.3.3 滴定使用硫酸溶液(2.12)进行滴定,滴定既可以在蒸馏过程中进行 ,也可以在蒸馏结束后对所有蒸馏液进行滴定。滴定终点的确定可以使用目测比色、光学探头或用 pH 计的电位分析判定。7.4 空白试验使用 7.3.1 到 7.3.3 的试剂,不加试样进行空白试验。注:可以用 1g 蔗糖(2.15)代替试验样
9、品。7.5 参考物质测试(检查试验)在五氧化二磷(2.8)的存在下,6080真空干燥参考物质。进行检查试验 ,试样的最小量根据 N-乙酰胺或色氨酸的含氮量决定 ,至少0.15g。注:可以在参考物质中加入 1g 蔗糖 (2.15） 。N-乙酰胺的氮回收率至少为 99.5%,色氨酸的氮回收率至少为 99.0%。8 8 结果表述结果表述8.1 氮含量氮含量(wN),以干基质量分数表示 ,按式(1)计算 :N(V1V0)c0.014100140c(V1V0)100 (1)m100Hm(100H)式中:V0空白试验滴定的硫酸溶液的量,单位为毫升（mL）;V1试样滴定的硫酸溶液的量，单位为为毫升（mL）
10、；0.014滴定 1mL0.5mol/L 硫酸溶液所需氮的量，单位为克（g）;c滴定所使用的硫酸溶液的摩尔浓度，单位为摩尔/升（mol/L） ；m试样的质量,单位为克（g）;H试样的水分。结果保留两位小数。8.2 粗蛋白含量根据谷物或豆类品种的不同采用相应的换算系数（见附录 C，其他通常用 6.25） ，乘以测定的氮含量 (11.1)值，计算得到干物质的粗蛋白含量。结果保留两位小数。9 9 精密度精密度9.1 实验室间实验附录 A 详述了方法精密度的实验室间实验结果。这些实验室间实验结果可能不适用于附录以外的其他浓度范围。9.2 重复性在不同实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方
11、法，对同一被测试对象互相独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值大于重复性限r的情况不超过 5%，重复性限r按式（2）计算：r=(0.0063P)2.8 （2）式中：P以干基产品质量分数表示的样品粗蛋白含量（见表 B.1） 。对于粗蛋白含量在 7%80%的产品，见表 A.1 和图 A.1。9.3 再现性在不同实验室,由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法,对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值大于再现性限R的情况不超过 5%，再现性限R按式（3）计算：R=(0.014P)2.8 (3)对于粗蛋白含量在 7%80%的产品,见表 A.1 和图 A1。9.4 临界
12、差9.4.1 同一实验室两组测定结果的比较在重复性条件下进行两组测定的结果平均值之间的临界差按式(4)计算:CDr=1.98Sr=1.98(0.063P)=0.01247P (4)9.4.2 两个实验室间两组测定结果的比较在不同实验室在重复性条件下进行两组测定的结果平均值之间的临界差按式(5)计算:2CDR 2.8SR 0.5Sr2 2.8(0.014 P)2 0.5 (0.0063 P)2=0.03716P (5)1010 测试报告测试报告测试报告应规定:a）完整的识别样品所需的全部信息;b) 如果已知取样方法,应说明使用的扦样方法;c) 采用的参考本标准的测定方法；d) 使用的换箅系数 (
13、见 11.2 中注） ；e) 所有本标淮中没有具体说明的、或者被认为是可选择的，以及可能影响测试结果的操作细节;F)测试结果,如果进行了重复性实验，应说明两次测定的结果和平均结果。1111 实验数据记录实验数据记录样品名称样品名称检验日期检验日期方法依据方法依据仪器型号仪器型号试验次数试验次数试样质量试样质量 m(g)m(g)滴滴 定定 试试 样样 消消 耗耗0.05mol/L0.05mol/L硫酸标准滴定硫酸标准滴定溶液的体积溶液的体积 V V1 1（mLmL）空空 白白 试试 验验 消消 耗耗0.05mol/L0.05mol/L硫酸标准滴定硫酸标准滴定溶液的体积溶液的体积 V V0 0（mLmL）硫酸标准滴定溶液硫酸标准滴定溶液的摩尔浓度的摩尔浓度 c c（mol/Lmol/L）样品编号样品编号环境状况环境状况1 12 2氮含量氮含量(w(wN N) )粗蛋白含量粗蛋白含量