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1、实验七考马斯亮蓝 G250 法测定的蛋白质含量一、试验目的1.学习分光光度计的原理及操作2.学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度二、基本原理1.根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光光度法。该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在 200-800 nm 之间的光。2.分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。3 紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样 品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸
2、收小于 190nm 波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm-400nm。可见光区为 400nm-800nm。4.考马斯亮蓝 G250 法原理：考马斯亮蓝 G250 与蛋白质结合后，其最大吸收波长从 465nm 改变为595nm 该蛋白-染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定 1 卩g/mL 的蛋白质，染料和蛋白结合只需要 2 分钟，颜色在 1 小时内稳定。操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。去污剂，粘多糖等严重 干扰该方法的测定三、试剂1.标准蛋白质溶液：0.5mg/ml 牛血清白蛋白溶液2.考马斯亮蓝 G250 蛋白染色剂：四、操作步骤1.标准曲线的
3、绘制：取 6 只试管，分别加入浓度为 0,0.1,0.2,0.3,0.4，0.5mg/ml 的标准蛋白质溶液 0.1ml，然后加入 5ml 考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2 分钟后于 595nm 测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。2.样品测定：样品液 0.1mL,然后加入 5ml 考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2 分钟后于 595nm 测定吸光值。从标准曲线中查出相应的浓度。五、试验结果1.数据记录标准蛋白质溶液浓度 mg/ml00.1020.30.40.5C吸光度 A00.0210.0370.0560.0700.1070.0172 标准曲线的绘制标准曲线00.10.20
4、.30.40.50.6标准蛋白质溶液浓度 mg/ml3.样品的测定根据标准曲线可以找出样品对应的点(0.085mg/ml。六.结果讨论0.085,0.017),所以样品的浓度为注意事项：1.分光光度计必须放置在固定而且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。严 防震动、潮湿和强光直射。2.盛待测液时，必须达到比色杯 2/3 左右，不宜过多。若不慎使溶液流出比色杯外面，必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净才能放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。3.千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯光滑面。4.用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。5.每套分光光度计上的比色杯及比色槽不能随意更换。