《山东省地方标准 水质 磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的测定 固相萃取液相色谱-三重四极杆质谱法（定稿）.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《山东省地方标准 水质 磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的测定 固相萃取液相色谱-三重四极杆质谱法（定稿）.doc（16页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS 13.060Z 16DB37山东省 地方标准DB 37/T XXXXXXXXX水质 磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗 生素的测定 固相萃取/液相色谱-三重四 极杆质谱法Water quality-Determination of antibiotics of Sulfonamides, Quinolones and Macrolides by solid phase extraction -Liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometryXXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施山东省市场监督管理
2、局 发 布DB37/T XXXXXXXXXI目 次前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 方法原理.14 干扰与消除.15 试剂和材料.16 仪器和设备.27 样品.38 分析步骤.39 结果计算与表示.510 精密度和准确度.711 质量保证和质量控制.712 废物处理.8附录 A（规范性附录） 方法的检出限和测定下限 .9附录 B（资料性附录） 质谱参考条件 .10附录 C（资料性附录） 方法的精密度和准确度 .11DB37/T XXXXXXXXXII前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省生态环境厅提出并组织实施。 本标准由山东省环保标准化技术委员
3、会归口。 本标准起草单位：山东省环境监测中心。 本标准主要起草人：郭文建、张慧、朱晨、王桂勋、岳太星、李红莉、丁波涛。DB37/T XXXXXXXXX1水质 磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的测定 固相萃取/ 液相色谱-三重四极杆质谱法警告：实验中使用的溶剂和试剂均具有一定的毒性，对健康具有潜在的危害，应尽量避免与这些 化学品的直接接触。样品制备过程应在通风橱中进行，操作时应按规定要求佩戴防护器具,避免接触皮 肤和衣物。1 范围本标准规定了测定水中磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的固相萃取/液相色谱-三重四极杆 质谱法。 本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中磺胺间甲氧嘧啶、磺胺
4、嘧啶、磺胺二甲氧 嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、脱水红霉素、罗红 霉素、螺旋霉素12种抗生素的测定。 当取样500 ml，定容体积为1.0 ml，进样体积为20 l时，方法检出限为0.001 g/L0.007 g/L，测定下限为0.004 g/L0.028 g/L，详见附录A。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 HJ/T 164 地下水环境监测技术规范3 方法原理水样中
5、的抗生素类化合物经固相萃取法富集、净化后，用液相色谱-三重四极杆质谱法分离检测。 根据化合物的保留时间和特征离子峰定性，内标法定量。4 干扰与消除金属离子与抗生素能形成络合物，使固相萃取效率降低，可向水样中加入乙二胺四乙酸二钠抑制 络合物的形成。水中余氯等其他具有氧化性的有机物会干扰磺胺类抗生素的测定，可向水中加入抗坏 血酸消除干扰。5 试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为不含目标化合物的纯水。 5.1 盐酸：（HCl）=1.19 g/ml。DB37/T XXXXXXXXX25.2 硫酸：（H2SO4）=1.84 g/ml。 5.3 乙腈（CH3CN）：色谱
6、纯。 5.4 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 5.5 甲酸（HCOOH）：色谱纯。 5.6 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O82H2O）。 5.7 抗坏血酸（C6H8O6）。 5.8 盐酸溶液：1+1。 5.9 硫酸溶液：c(H2SO4)=4.0 mol/L。量取 22 ml 硫酸（5.2），缓慢加入到水中，待温度降至室温 后，用水定容至 100 ml。 5.10 pH 2.0 去离子水：用盐酸（5.8）溶液调节去离子水至 pH 为 2.0。 5.11 0.1 %甲酸溶液：量取 0.5 ml 甲酸（5.5），缓慢加入水中，用水定容到 500 ml。 5.12 甲醇/乙腈混合溶液：1+1
7、。 5.13 0.1 %甲酸甲醇/乙腈混合溶液：量取 0.5 ml 甲酸（5.5），缓慢加入到甲醇/乙腈混合溶液 （5.12）中，用甲醇/乙腈混合溶液（5.12）定容至 500 ml。 5.14 稀释溶剂：3+1。取 75 ml 0.1 %的甲酸溶液（5.11）和 25 ml 0.1 %甲酸甲醇/乙腈混合溶液 （5.13）于玻璃容器中，混合均匀。 5.15 标准贮备液：=100 mg/L。准确称取 10.0 mg 抗生素类化合物标准物质，用甲醇溶解后，转移 到 100 ml 棕色容量瓶中，定容至标线。此溶液在-10 以下避光可保存 1 年。也可以直接购买有证标 准溶液，参照制造商的产品说明保存
8、。 5.16 脱水红霉素标准贮备液：=2.00 mg/L。脱水红霉素可直接购买标准物质（纯度95 %）或者 由红霉素制备。量取 400 l 100 mg/L 红霉素贮备液于 20 ml 棕色瓶中，加入 19.6 ml 甲醇（5.4）， 然后加入约 10 l 硫酸溶液（5.9）调 pH 至 3.0，室温下震荡 4 h，于-10 以下避光可保存 2 个月。5.17 标准使用液：=1.00 g/ml。将 12 种抗生素类化合物标准贮备液（5.15）用适量的甲醇 （5.4）稀释，临用现配。 5.18 内标贮备液：=200 g/ml。内标物为阿特拉津-13C3。可用标准物质配制，标准物质纯度大于 99.
9、0 %，用适量的甲醇（5.4）溶解。也可直接购买有证标准溶液。贮备液应在-10 以下避光保存或 参照制造商的产品说明。 5.19 替代物贮备液：=200 g/ml。喹诺酮类替代物为环丙沙星-D8，磺胺类替代物为磺胺二甲氧 嘧啶-D6、大环内酯类替代物为脱水红霉素-D6。可用标准物质配制，标准物质纯度大于 99.0 %，用适 量的甲醇（5.4）溶解。也可直接购买有证标准溶液。贮备液应在-10 以下避光保存或参照制造商的 产品说明。 5.20 内标使用液：2.00 g/ml。将内标贮备液（5.18）用适量的甲醇（5.4）稀释。内标使用液于- 10 以下避光保存，保质期 1 个月。 5.21 替代物
10、使用液：2.00 g/ml。将替代物贮备液（5.19）用适量的甲醇（5.4）稀释。替代物使 用液于-10 以下避光保存，保质期 1 个月。 5.22 固相萃取柱：填料为二乙烯苯和 N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）或同等柱效的萃取柱，规格 为 6 ml/500 mg。 5.23 滤膜：0.7 m 玻璃纤维或其他材质等效滤膜。 5.24 滤膜：0.22 m 聚四氟乙烯或其它等效滤膜。 5.25 氮气：纯度99.99 %。6 仪器和设备DB37/T XXXXXXXXX36.1 液相色谱-三重四极杆质谱仪：配有电喷雾离子化源（ESI）。 6.2 固相萃取装置：自动或手动，流速可调节。 6.3 浓缩装
11、置：自动氮吹浓缩仪或 K-D 浓缩器等性能相当的设备。 6.4 色谱柱：填料粒径为 1.8 m，柱长 50 mm，内径 4.6 mm 的 C18反相色谱柱，或其他等效色谱柱。6.5 样品瓶：1 000 ml 带聚四氟乙烯内衬垫瓶盖的棕色玻璃瓶。 6.6 微量注射器：10 l、20 l、50 l、100 l、250 l。 6.7 一般实验室常用仪器和设备。7 样品7.1 样品采集与保存按照HJ/T 91和HJ/T 164的相关规定采集样品。样品采集前，应向样品瓶（6.5）中加入150 mg抗 坏血酸（5.7）及0.25 g乙二胺四乙酸二钠（5.6），采样时应使样品充满样品瓶（6.5），不留液上空
12、 间。样品采集后于现场立即加盐酸溶液（5.8）调节样品pH至2。 样品采集后应尽快进行分析。如暂不能分析，需在0 4 冷藏避光保存，3 d内分析完毕。7.2 试样制备7.2.1 样品预处理样品采用固相萃取法富集前，先用孔径为0.7 m的玻璃纤维膜（5.23）过滤。7.2.2 固相萃取法将固相萃取柱（5.22）固定在固相萃取装置（6.3）上。分别用5 ml甲醇（5.4）、5 ml去离子水、 5 ml pH 2.0去离子水（5.10）活化萃取柱，待萃取柱上pH 2.0去离子水剩约2 ml左右时，量取500 ml 水样，加入25.0 l替代物使用液（5.21），用盐酸溶液（5.8）调节水样pH为24
13、，水样以1015 ml/min的流速全部通过萃取柱后，用5 ml去离子水淋洗小柱，再用氮气（5.25）吹扫20 min，使萃取 柱干燥。然后加入10 ml甲醇（5.4）以5 ml/min的流速洗脱，收集洗脱液。洗脱液经氮吹仪浓缩至近 干，加入内标使用液（5.20）25.0 l，用稀释溶剂（5.14）定容到1.0 ml，过0.22 m（5.24）有 机滤膜后待测。7.3 空白试样制备以实验用水代替样品，按照与试样的制备（7.2）相同步骤进行实验室空白试样的制备。8 分析步骤8.1 仪器参考条件8.1.1 液相色谱参考条件流动相：A相：0.1 %甲酸甲醇/乙腈混合溶液（5.13）。B相：0.1 %
14、甲酸溶液（5.11）。 流速：0.3 ml/min。 柱温：40 。 进样体积：20 l。DB37/T XXXXXXXXX4表 1 梯度洗脱程序时间（min）流动相 A（%）流动相 B（%）02575225751860402060402125752525758.1.2 质谱参考条件离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式。 毛细管电压：4 000 V，干燥气体温度：350 ，雾化器压力：35 psi。 干燥气体流速：10 L/min。 多离子反应监测方式（MRM），具体条件参见附录B。对于不同质谱仪器，参数可能存在差异，测 定前应将质谱参数优化到最佳。8.1.3 仪器调谐按照仪器使用说明书的
15、要求在规定时间和频次内对液相色谱-三重四极杆质谱仪进行仪器质量轴和 分辨率调谐，使仪器处于最佳测试状态。 在仪器使用过程中，如发现仪器质量数出现明显偏差或灵敏度明显下降时，应立即重新对仪器进 行质量轴和分辨率调谐。8.2 校准曲线的建立取一定量抗生素类化合物标准使用液（5.17）、内标使用液（5.20）及替代物使用液（5.21）于2 ml样品瓶中，制备至少5个浓度点标准系列，抗生素类化合物和替代物在各点的质量浓度分别为2.00 g/L、5.00 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L、50.0 g/L、100 g/L和200 g/L（参考浓度）， 内标的质量浓度均为50.0 g/L。 由低
16、浓度到高浓度依次对标准系列溶液进样，以标准系列溶液中目标组分的质量浓度为横坐标， 其对应的峰面积（或峰高）与内标物峰面积（或峰高）的比值乘以内标物浓度的乘积为纵坐标，建立 校准曲线。8.3 试样测定按照与校准曲线的建立（8.2）相同的条件进行试样（7.2）测定。DB37/T XXXXXXXXX58.4 空白试验按照与试样测定相同的条件（8.3）进行空白试样（7.3）的测定。9 结果计算与表示9.1 定性分析每种被测组分选择1个母离子和2个子离子进行监测。在相同的实验条件下，某待测组分在样品中 的保留时间与标准溶液中的保留时间的相对标准偏差小于2.5 %，且在试样谱图中的定性离子的相对丰 度（K
17、sam）与浓度相近的标准溶液谱图中对应的定性离子相对丰度（Kstd）偏差不超过表2的范围，则可 判定样品中存在该待测物。12种抗生素类化合物、3种替代物及1种内标物的总离子流色谱图见图 1，MRM谱图见附录C。.(1)12 AAKsam式中： Ksam样品中某组分定性离子的相对丰度，%； A2 样品中某组分定性离子对的峰面积（或峰高）； A1 样品中某组分定量离子对的峰面积（或峰高）。.(2)12stdstd stdAAK式中： Kstd 标准溶液中某组分定性离子的相对丰度，%； Astd2标准溶液中某组分定性离子对的峰面积（或峰高）； Astd1标准溶液中某组分定量离子对的峰面积（或峰高）。
18、表 2 定性确认时相对离子丰度的最大允许偏差单位：%标准溶液中某组分的定性离子的相对离子丰度（Kstd）Kstd5020Kstd5010Kstd20Kstd10样品中某组分的定性离子的相对离子丰度（Ksam）的最大允许偏差20253050DB37/T XXXXXXXXX6说明：1磺胺嘧啶；2氟罗沙星；3氧氟沙星；4诺氟沙星；5环丙沙星-D8；6环丙沙星；7磺胺二甲嘧啶；8磺胺间甲氧嘧啶；9磺胺甲恶唑；10螺旋霉素；11磺胺二甲氧嘧啶；12磺胺二甲氧嘧啶-D6；13阿特拉津-13C3；14脱水红霉素；15脱水红霉素-D6；16罗红霉素。图 1 目标物、替代物及内标物的总离子流色谱图（=100 g
19、/L，内标 50 g/L）9.2 定量分析样品中各抗生素组分的质量浓度i（g/L）按照公式（3）进行计算。.(3)式中： i 样品中目标化合物i的质量浓度，g/L； Ai 样品中目标化合物i的峰面积（或峰高）； Ais 样品中内标物的峰面积（或峰高）； is样品中内标物的质量浓度，g/L； a 校准曲线的斜率；DB37/T XXXXXXXXX7b 校准曲线的截距； Vi 定容体积，ml； V 水样体积，ml。9.3 结果表示测定结果的小数点位数与方法检出限一致，最多保留三位有效数字。10 精密度和准确度10.1 精密度6家实验室对抗生素浓度为0.040 g/L、0.200 g/L、0.400
20、g/L统一加标样进行了6次重复测 定： 实验室内相对标准偏差分别为0.8 %17 %、1.4 %17 %、1.3 %17 %；实验室间相对标准偏差 分别为9.7 %18 %、11 %17 %、11 %16 %；重复性限范围为0.0090.012 g/L、0.0320.052 g/L、0.0520.092 g/L；再现性限范围为0.0130.021 g/L、0.0600.102 g/L、0.0960.160 g/L。10.2 准确度6家实验室对地下水、地表水、生活污水和工业废水进行加标回收实验，加标浓度分别为0.040 g/L、0.200 g/L、0.200 g/L、0.400 g/L。加标回收
21、率范围分别为75.5 %102 %、76.3 %88.5 %、72.3 %97.8 %，77.6 %90.3 %；加标回收率最终值为77.8 %30.8 %102 %31.2 %、77.5 %30.6 %85.5 %31.6 %、77.5 %25.8 %97.8 %32.0 %、77.6 %27.2 %90.3 %29.4 %。 精密度和准确度结果统计见附录C。11 质量保证和质量控制11.1 空白实验每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中目标化合物的浓度应低于方法检出限。11.2 校准校准曲线的相关系数应0.990；每20个样品或每批次（少于20个样品/批）应分析测定1个校准曲 线中间浓
22、度点的标准溶液，测定结果与曲线该点浓度的相对误差应在20 %以内，否则需重新建立校 准曲线。11.3 平行样的测定每20个样品或每批次（少于20个样品/批）需分析一个平行样。平行样的相对标准偏差应控制在25 %以 内。11.4 基体加标每20个样品或每批次（少于20个样品/批）需做一个基体加标样，加标回收率应在60 %130 %之 间。DB37/T XXXXXXXXX811.5 替代物加标每个样品均需要加入替代物，替代物回收率应控制在60 %130 %之间。12 废物处理实验操作过程产生的有机溶剂废液应集中保管，委托有资质的单位进行处理。DB37/T XXXXXXXXX9A A附 录 A （规
23、范性附录） 方法的检出限和测定下限表A.1给出了本方法中目标化合物的检出限和测定下限。表 A.1 方法的检出限和测定下限序号化合物CAS所属类别方法检出限（g/L）测定下限（g/L）1磺胺嘧啶68-35-9磺胺类0.0010.0042磺胺二甲嘧啶57-68-1磺胺类0.0010.0043磺胺间甲氧嘧啶1220-83-3磺胺类0.0010.0044磺胺甲恶唑723-46-6磺胺类0.0010.0045磺胺二甲氧嘧啶122-11-2磺胺类0.0010.0046氟罗沙星79660-72-3喹诺酮类0.0020.0087氧氟沙星82419-36-1喹诺酮类0.0030.0128诺氟沙星70458-96
24、-7喹诺酮类0.0030.0129环丙沙星85721-33-1喹诺酮类0.0030.01210螺旋霉素8025-81-8大环内酯类0.0070.02811脱水红霉素23893-13-2大环内酯类0.0020.00812罗红霉素80214-83-1大环内酯类0.0020.008DB37/T XXXXXXXXX10B B附 录 B （资料性附录） 质谱参考条件目标化合物、替代物及内标物的多离子反应监测条件见表B.1。表 B.1 目标化合物、替代物及内标物的多离子反应监测条件种类名称母离子(m/z)定量、定性离子（m/z）定量、定性碰撞电压（V）毛细管出口电压（V）内标阿特拉津-13C3218.61
25、77.2*，106.215，20110磺胺间甲氧嘧啶281.1156.1*，108.115，26100磺胺嘧啶251.1156.0*，108.010，22100磺胺二甲氧嘧311.0156.0*，108.020，26130磺胺二甲氧嘧啶-D6316.4162.0*，108.021，29110磺胺甲恶唑254.1156.0*，108.010，25100磺胺类磺胺二甲嘧啶279.1186.1*，156.115，16120诺氟沙星320.0302.1*，276.120，15130环丙沙星332.1314.1*，231.020，42135环丙沙星-D8340.1322.1*，296.020，9125氧
26、氟沙星362.0318.1*，261.115，26130喹诺酮类氟罗沙星370.1326.0*，269.015，25130脱水红霉素716.5158.1*，558.025，14170脱水红霉素-D6722.0164.1*，564.029，14158螺旋霉素422.2174.0*，101.021，23100大环内酯类罗红霉素837.5158.0*，679.438，18170注：带*的为定量离子DB37/T XXXXXXXXX11C C附 录 C （资料性附录） 方法的精密度和准确度表C.1和C.2分别给出了方法的精密度和准确度。表 C.1 方法的精密度化合物名称加标浓度（g/L）平均值（g/L）
27、实验室内相对标准偏差（%）实验室间相对标准偏差（%）重复性限r（g/L）再现性限R（g/L）0.0400.0302.2-14.812.00.0090.0130.2000.1601.4-10.413.30.0330.060磺胺嘧啶0.4000.3332.0-9.615.60.0520.1300.0400.0312.9-13.317.50.0100.0170.2000.1662.0-14.511.80.0400.070磺胺二甲嘧啶0.4000.3372.3-10.615.20.0660.1500.0400.0313.2-12.917.10.0090.0200.2000.1563.1-13.212.
28、70.0420.071磺胺间甲氧嘧啶 0.4000.3211.4-9.819.50.0580.1500.0400.0333.8-13.017.30.0110.0110.2000.1642.8-14.615.50.0460.083磺胺甲恶唑0.4000.3112.2-15.312.80.0680.1400.0400.0354.9-14.89.70.0110.0160.2000.1742.5-16.912.80.0430.069磺胺二甲氧嘧啶 0.4000.3382.5-14.011.60.0670.0960.0400.0383.6-14.57.00.0100.0130.2000.1761.4-1
29、4.916.40.0520.100氟罗沙星0.4000.3301.7-16.615.50.0810.1400.0400.0383.8-14.210.20.0110.0150.2000.1892.5-13.715.60.0400.085氧氟沙星0.4000.3341.9-13.314.00.0810.1600.0400.0393.0-13.213.40.0100.0180.2000.1743.4-12.413.30.0460.083诺氟沙星0.4000.3171.5-14.913.60.0860.1500.0400.0391.9-13.516.90.0110.021环丙沙星 0.2000.171
30、4.4-12.411.00.0460.083DB37/T XXXXXXXXX120.4000.3221.7-16.414.60.0920.160表 C.1 方法的精密度（续）化合物名称加标浓度（g/L）平均值（g/L）实验室内相对标准偏差（%）实验室间相对标准偏差（%）重复性限r（g/L）再现性限R（g/L）0.0400.03231.5-15.312.00.0100.0160.2000.1652.7-14.716.70.0320.083螺旋霉素0.4000.3430.9-12.313.50.0920.1400.0400.0411.0-12.115.20.0110.0200.2000.1712.
31、0-13.714.50.0420.093脱水红霉素0.4000.3522.0-15.012.70.0820.1100.0400.0390.8-16.515.40.0120.0200.2000.1641.6-11.216.90.0350.087罗红霉素0.4000.3481.3-13.811.40.0770.126表 C.2 方法的准确度化合物名称样品类型实际样品浓度（g/L）加标浓度（g/L）回收率范围（%）（%）SP2地下水0.0000.04066.491.175.517.2地表水0.0000.20062.885.778.516.4生活污水0.0000.20060.697.077.222.4
32、磺胺嘧啶工业废水0.0000.40063.310288.029.2地下水0.0000.04064.510176.427.4地表水0.0000.20064.186.976.319.4生活污水0.0000.20070.599.882.419.4磺胺二甲嘧啶工业废水0.0000.40077.693.487.013.2地下水0.0000.04066.810277.830.8地表水0.0000.20063.096.480.030.2生活污水0.0000.20063.292.376.319.2磺胺间甲氧嘧啶工业废水0.0000.40070.411385.534.6地下水0.0000.04066.397.2
33、81.529.8地表水0.0000.20063.210381.829.6生活污水0.0190.20066.610083.127.0磺胺甲恶唑工业废水0.0000.40071.192.177.916.0磺胺二甲氧嘧啶地下水0.0000.04078.398.788.018.6DB37/T XXXXXXXXX13地表水0.0000.20067.189.880.218.4生活污水0.0000.20082.211793.825.0工业废水0.0000.40080.210690.218.6表 C.2 方法的准确度（续）化合物名称样品类型实际样品浓度（g/L）加标浓度（g/L）回收率范围（%）（%）SP2地
34、下水0.0000.04083.010392.613.0地表水0.0000.20065.810385.531.6生活污水0.1480.20066.697.681.921.6氟罗沙星工业废水0.0000.40061.794.677.627.2地下水0.0000.04081.110996.019.4地表水0.0000.20062.497.377.530.6生活污水0.0000.20086.612897.832.0氧氟沙星工业废水0.1940.40071.310281.522.8地下水0.0000.04086.112198.526.4地表水0.0000.20072.493.582.216.6生活污水0
35、.0000.20075.010987.322.8诺氟沙星工业废水0.0000.40063.493.780.622.4地下水0.0000.04079.512897.232.8地表水0.0000.20073.294.186.016.6生活污水0.0860.20075.410284.819.2环丙沙星工业废水0.0000.40065.796.680.325.2地下水0.0000.04069.692.379.417.2地表水0.0000.20071.596.381.018.0生活污水0.0000.20061.295.377.525.8螺旋霉素工业废水0.0000.40065.110484.626.8地下水0.0000.04080.912810231.2地表水0.0000.20075.598.287.119.8生活污水0.0450.20072.288.180.112.0脱水红霉素工业废水0.0410.40076.311890.329.4地下水0.0000.04081.312399.429.6地表水0.0000.20073.497.288.519.3生活污水0.0650.20069.174.772.33.9罗红霉素工业废水0.0500.40069.398.685.322.1_