考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究.doc

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1、第 23 卷第 3 期 天 津 化 工 Vol 23 No 3 2009 年 5 月 Tianjin Chemical Industry May.2009 考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究 王孝 平 ， 邢 树礼 （ 青 岛科 技大学 药学 系 ， 山东 青岛 266042） 摘要 ： 采用考马斯亮蓝 G-250 染色法对蛋白质含量进行了测定 ， 建立了快速 、 灵敏的检测蛋白质的方法 。 结果表明 ， 考马斯亮蓝 G-250 染色法简单 、 迅速 ， 且相对较为准确 ， 是测定低浓度蛋白质含量的有效方法 。 关键词 ： 蛋白质 ； 考马斯亮蓝 ； 含量测定 中图分类号 ： R927.2 文献标

2、志码 ： A 文章编号 ： 1008 1267 2009 03-0040-03（ ） 在许 多 蛋白 质 研究 的 领域 中 ，用 一 种 快速 准 确 平时 应将 该标 准液 放在 -20 的 环境 中储存 。 的方 法来 检测 蛋白浓 度是 必不 可少 的。 一种 新建 立 1.3 塑胶 制品 及玻 璃制 品 的 考 马斯 亮 蓝 法 在 许 多 实 验 中 已 成 为 首 选 方 法 用 在利 用分光 光度 计测量 吸光 度时 ， 所 用的 比色 来定 量的 检测 蛋白浓 度 。与 传统 的 Lowry 法 相比 ，该 皿应该 是塑料的 或玻 璃的，并且用 之前应绝对 保证清 法 更易

3、操 作 ， 更 快， 更 灵 敏 ，此 外 ， 它 受 其 他 一 些 试 洗干 洁，禁 止使用 石英 （成分 为二 氧化 硅） 比色皿 ，因 剂和 非蛋 白成 分干扰 也较 小。 为染 料会 跟二 氧化 硅发生 共价 结合 3，而染 料粘 到玻 该 考 马 斯亮 蓝 法 其 检 测 原 理 是 基 于 染 料 考 马 璃或塑 料比色皿上时 ，可以用甲醇 或洗涤剂清洗 掉。 的 研究 表 明 ，该 染 料 可 以 自 由 存 在 于 四 种 不 同 的 就可 以 算出 蛋 白质 的 量 ， 这 通 常 可以 在 595 nm 处 测定 吸光 度获 得。 测时 结 果差 异 较大 ， 这是 此

4、方法 的 主要 缺 陷。 原 考 马 斯 亮蓝 检 测 表 明 反 应 之 间 的 不 同 的 蛋 白 质 会 有 较大 变 化。 为 了克 服 这个 问 题， 发 展并 建 立了 几 种 改进 的方 法。 595 nm 下测 定样 本的 A 值 （ 见注 意事 项 3.2）。 100 1.1 试剂 g 标 准 在 595 nm 下的 A 值 应在 0.4 左 右。 标 准曲 检测试剂是： 100 mg 考马斯亮蓝 G250 溶于 50 mL 线 不 是 直线 ， 和 精 确 的 吸 收 不 同 ，要 看 检 测 试 剂 的 95% 乙 醇 中 ， 然 后 与 100 mL 85%磷 酸 混

5、合 ，用 蒸 馏 放置 时间 。 因此， 每套 检测 都要 新建一 个标 准曲 线。 水稀 释定 容至 1L。 2.2 微量 测定 方法 1.2 标准蛋 白质 液 这 种 形 式 的 检 测 针 对 较 为 灵 敏 的 蛋 白 质 。 因 测定 时浓 度用 100 g/mL）液 作标 准。 为保证 固体 蛋 作者简介 ：王孝平（ 1982-），男，青 岛科技大 学硕士研 究生。 邢 树礼 白中 的 水分 含 量在 贮 藏过 程 中不 会 发生 大 的 变化 ， （ 1983-），男，青岛科技大学药剂学硕士研究生。 斯蓝 G250 和蛋 白 质之 间形 成的 特 异性 结 合 。 详 细 2 方

6、法 1 标准 测定 方法 离子形 式中 。 相比 之 下， 染 料更 多 的阴 离 子形 式 与 2.1.1 在 小试 管中 依次 按梯 度加 入 100 L 中含 10 蛋白质 结合 且 结合 后 显 蓝色 ， 在 左右 具 有 到 100 g 蛋白 质。 如果 近似 样本浓 度是 未 知， 可以 最大吸收 。 因 此通 过定 量测 定染料 的蓝 色离 子的 量 测定 一系 列稀 释品 （如 1， 1:10， 1:100， 1:1000）。 准备 重复每个 样品 。 2.1.2 为校 正 曲线 ， 取体 积 为 10， 20， 40， 60，80 和 这 种 染 料最 容 易 与 蛋 白 质

7、 中 的 精 氨 酰 和 赖 氨 100L 的 1 mg/mL 标准 牛 -球 蛋白 到小管 中， 蒸馏 酰键结 合 ，这 种 特 异 性 可 导 致 对 不 同 的 蛋 白 质 检 水补 至 100 L。 取 100 L 的 蒸馏水作 为空白试 剂。 2.1.3 每管 添加 5 mL 蛋 白 质的 试剂 ， 倒转 或 者摇 动 使 其 混合 均 匀 ， 动 作 要 轻 以 免 产 生 泡 沫 ，否 则 重 现性 会降 低。 混 合 后 到 内 以 标 准 液 为 空 白 在 材料以浓 度为 1 mg/mL 的 牛 - 血清 球蛋 白（ 在微 量 收稿日期 ： 2008 12 08 第 23

8、卷第 3 期 王孝平等：考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究 41 此 ， 当 未 知 蛋 白 含 量 很 少 的 时 候 是 非 常 适 用 的 。 吸收 波长 。 不 过，在 通常 的 pH 值 下， 为了 简单起 见， 2.2.1 复含 有 在 总量 为 100 L 到 1.5 mL 聚 乙烯微 管中 重 1 到 10 g 的 样本 。 如果 近似 样本 浓 度是 未 作 为 染 料 -蛋 白 复 合 物 的 折 中 我 们 经 常 以 595 nm 作为 测量 波长 。 知 ， 可 以 测 定 一 系 列 稀 释 品 等 ）。 （ 如 1， 1 10， 1100， 1 3.3 该染 料不 与

9、单 体精 氨酸 、赖氨 酸以 及相 对 分子 1000 质 量小 于 3000 的 多肽 结 合。 许 多 肽类 激 素 和其 他 2.2.2 为 校 正曲 线 ， 取 体 积为 10， 20， 40， 60， 80 和 一 些重 要 的活 性 肽也 在 这一 范 围内 ，所 以 该 考马 斯 5 100 L 的 100 g/mL 的 标 准 牛 - 球 蛋 白 到 微 管 中，并 补蒸 馏水 至 。 取 的 蒸馏 水作 为 亮蓝 法不 适用 于对 这些 化合 物的 定量测 定 。 100 L 100 L 3.4 这 里 描 述 的 这 种 方 法 在 检 测 不 同 种 类 的 个 空白 。

10、 别 蛋 白 质 时 在 灵 敏 度 上会 有 差 异 。 通 常 我 们 可 以 2.2.3 每 管添 加 1 mL 蛋 白质 试剂 ，轻 轻混合 均匀 。 通 过 增 加 染 料 的 浓 度 或 增 加 溶 液 的 pH 值 的 方 法 来 减 小 这 一 差 异 。 例 如 ， 向 反 应物 中 加 入 NaOH 以 33.1 注意事项 该 考马 斯 亮 蓝法 是 最 常 用的 生 化 试剂 测 蛋 白 调 整 pH 值 来 提 高 该 方 法 的 敏 感 度 ， 低了 测 量 不 同 的 蛋 白 质之 间 的 差 异 。 结 果 大 大 降 此 外 ， 这 些 含量 的 方法 里 比较

11、 不 受干 扰 的一 种 。 但 是 ，有 少 数 改良 后 的 方 法 对 消 除 样品 中 去 污 剂 的 影 响 也 是 十 的化 学 药品 （ 尤其 是 一些 去 污剂 和 两性 电 解质 ）， 其 空 白试 剂 或 与 蛋 白 染 料 反 应 后 它 们 的 吸 光 度 可 能 会有 显著 改变 （见 表 1）， 这些 物质 可 以用 凝胶 过滤 ， 透析 ，或 磷 酸 钙沉 淀 蛋白 质 的方 法 从样 品 溶液 中 除 去， 这也 是 目前 测 量 蛋白 质 含量 时 集中 存 在的 一 个 问题 。 表 1 一般反应物在考马斯亮蓝法中的影响 吸收波长为 600 nm、 5 mg

12、 免疫球蛋白 0.02%SDS 0.003 0.250 0.1%SDS 0.042 0.059 1M 2-巯基乙醇 0.006 0.273 1M 蔗糖 0.008 0.261 4M 尿素 0.008 0.261 4M NaCl -0.015 0.207 甘油 0.014 0.238 0.1M HEPES pH7.0， 0.003 0.268 0.1M 三羟甲基氨基甲烷， pH7.5 -0.008 0.261 0.1M pH5.0 0.015 10mM EDTA 0.007 0.235 1M NH4 2SO4 0.002 3.2 蛋 白 质 与 考 马 斯 亮 蓝 G250 的 特 异 性 结

13、合 可 能 会使 这 些 蓝 色 染 料 的 离 子 形 式 的 最 大 吸 收 波 长 从 590 nm 向 620 nm 转 移 ， 因 此 在 测 量 前 我 们 应 该 先 确 定 在 590 nm 至 620 nm 之 间 有 没 有 更 大 的 分 有 效 的 。 3.5 不 同 来源 或 不 同供 应 商 提供 的 染 料 的纯 度 不 同， 所 以它 们在 考马 斯 亮蓝 G250 中 的溶 解 度 可能 会 有差 异 ，但 对于 用 该方 法 对常 规 蛋白 质 进 行检 测 来 说染 料 的质 量 不是 特 别的 重 要， 因此 对 于 染料 质 量所 引起 的差 异这 里

14、不 做讨 论。 3.6 用 来 待测 定 的 蛋白 质 和 用来 建 构 校 准曲 线 的 蛋白 质应 该用 同 一种 。 通 常 牛血 清白 蛋白 （ BSA）是 常 用的 蛋 白质 标 准品 ，因 为 它价 格 便宜 而 且 质量 也 比 较纯 净 ，更 重要 的 是可 以 将带 测 样品 的 测 量结 构 直接 与它 的标 准曲 线进 行比 较。 参考文献 ： 1 Zuo,S.-S.and Lundahl,P.A micro-Bradford membrane pro- tein assayJ.Analyt.Biochem,2005,284:162-164. 2 Sedmak,J.J.a

15、nd Grossberg,S.E.A rapid,sensitive and versa- tile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue G250 J.Analyt.Biochem.2005,79:544-552. 3 Chial,H.J.,Thompson,H.B.,and Splittgerber,A.G.A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G250 J. Analyt.Biochem.2003,209:258-266. 4 Kirazov,L.P.,Ve

16、nkov,L.G.and Kirazov,E.P.Comparison of the Lowry and the Bradford protein assays as applied for protein estimation of membrane -containing fractions J. Analyt.Biochem.2005,208:44-48. 5 Friendenauer,S.and Berlet, H. H.Sensitivity and variability of the Bradford pro-tein assay in the presence of deter

17、gent J.s.Analyt.Biochem.2006,178:263-268. 化合物 空白 0.249 0.269 4 第 23 卷第 3 期 天 津 化 工 Vol 23 No 3 2009 年 5 月 Tianjin Chemical Industry May.2009 荧光黄法海水氯度测定的研究 高红 1 ， 齐 景霞 1 ， 李 建云 2 （ 1 天 津渤 海职 业技 术学 院 ， 天 津 300402； 2 石 药集 团恩必 普药 业有 限公 司 ， 河北 石家 庄 050000） 摘要 ： 实验采用荧光黄法测定海水中的氯度 。 实验中选用不同季节 、 不同深度的海水进行分析

18、， 得到景唐 港海域盐度的分布及变化因素 。 其盐度变化总趋势为表层低 ， 下层高 。 冬季表 层盐度比其它季节高 。 关键词 ： 荧光黄法 ； 海水盐度 ； 海水氯度 TQ124.4 1 A 1008-1267 2009 03-0042-02 本 文 根 据海 水 常 量 成 份 的 恒 定 性 和 氯 度 易 于 准确 测 定的 特 点， 采 用荧 光 黄法 测 定海 水 氯度 ， 再 析纯 。 1.1.3.1 硝 酸银 标准 溶液 由氯 度与 盐度 的经验 关系 式来 计算 盐度 。 硝 酸银 标准 溶 液的 配 制： 称取 16 g AgNO 3 置于 1 1.1 实验部分 仪器与 试

19、剂 500 mL 的 烧杯 中并 用 400 mL 蒸馏 水溶 解， 转移 于棕 色试 剂瓶 中备 用。 1.1.3.2 荧 光黄 钠盐 指示 剂 溶 解后 1.1.1 水 样的 采集 与贮存 （ 1） 0.1%荧 光黄 钠 盐 溶液 ： 配 制 0.1 mol/LNaOH 海水 是 一个 复 杂的 多 组分 的 多相 体 系 ，水 样 的 采取 和 贮存 是 极其 关 键的 一 步， 本 实验 水 样采 自 景 溶 液 150 mL ， 量取 10 mL 将 0.1 g 荧 光黄 溶于 其 中， 唐港 不 同深 度 的海 水 ，贮 存 容器 选 用密 封 良好 的 渗 透性 低 的高 密 度

20、聚 乙 烯容 器 ，并 把 不同 深 度水 样 贴 上标 签以 视区 别。 实 验中的 标准 海水 氯度 值为 17 19 1.1.2 仪 器 氯度 滴定 管； 15 mL 移液 管； 150 mL 烧 杯； 50 mL 容量瓶 ； 200 mL 海水 样品 瓶； 500 mL 棕 色试 剂瓶 ；玻 璃棒。 1.1.3 试 剂 试剂 中 除可 溶 性淀 粉 为化 学 纯外 ， 其 它均 为 分 并加 0.1 mol/L 稀硝 酸 溶液 中和 到中 性 ，然后 用 蒸馏 水稀 释到 100 mL，贮 于棕 色试 剂瓶 中。 （ 2） 1%淀 粉 溶 液 ：称 取 可 溶 性 淀 粉 （ A.R）

21、 2.5 g， 先 用少 量 蒸馏 水 调成 糊 状， 倒 入 250 mL 煮 沸的 蒸 馏水 中， 冷却 至室 温。 （ 3） 荧 光黄 钠 盐指 示 剂 ：取 0.1% 荧 光 黄 钠 盐 溶 液 12.5 mL 与 1%淀 粉 溶 液 250 mL 混 合 ； 并 加 入 0. 25 g 苯 甲 酸 钠 ，防 止 受 霉 菌 的 作 用 而 腐 败 。 收稿日期 ： 2008 11 12 Determination of protein quantitation using the method of coomassie brilliant blue WANG Xiao-ping, X

22、ING Shu-li (Department of Pharmacy,Qingdao University of Science and Technology, Shandong, Qingdao 266042,China) Abstract: The determination method of protein content by using the dying method with Coomassie brilliant blue G -250 has been developed.It is showed that the method is simplicity,rapidity and sensitivity for protein quantification assay,especially suitable for the determination of low content samples. Key words: protein;Coomassie brilliant blue;content determination + 1