高通量测序技术及其应用.doc

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1、中国生物工程杂志 China Biotechnology， 2012， 32（ 1） ： 109-114 高 通 量 测 序 技 术 及 其 应 用 * 王兴春 杨致荣 王 敏 李 玮 李生才 2 （ 1 山西农业大学生命科学学院 （ 3 太谷 030801 2 山西农业大学农学院 030801） 太谷 030801） 山西农业大学文理学院 太谷 摘要 高通量测序技术是 DNA 测序发展历程的一个里程碑，它为现代生命科学研究提供了前所 未有的机遇 。 详细介绍了以 454、 Solexa 和 SOLiD 为代表的第二代高通量测序技术，以 HeliScope TIRM 和 Pacific Bio

2、sciences SMRT 为代表的单分子测 序技术，以及最近 Life Science 公司推出 的 Ion Personal Genome Machine （ PGM） 测序技术等高通量测序技术的最新进展 。 在此基础上，阐述 了高通量测序技术在基因组测序 、 转录组测序 、 基因表达调控 、 转录因子结合位点的检测以及甲 基化等研究领域的应用 。 最后，讨论了高通量测序技术在成本和后续数据分析等方面存在的问 题及其未来的发展前景 。 关键词 高通量测序 深度测序 下一代测序 基因组测序 转录组测序 中图分类号 Q3 作为最重要的分子生物学分 析 方法之一 ， DNA 测 序不仅为遗传信息

3、的揭示和基因表达调控等基础生物 学研究提供重要数据 ， 而且在基因 诊断和基因 治疗等 应用研究中也发 挥着重要的 作用 。 随着科 学的发展 ， 传统的 Sanger 测序技术 的局限性日 益突出 。 一方面 ， 该技术依赖于毛细管电泳 ， 不但费时 ， 而且测序反应数 也受到限制 （ 目前常用的 ABI 3730 测序仪每次只能分 析 96 个样品 ） ； 另一方面 ， 该技 术基于酶法测序 ， 成本 较高 。 自 2005 年 以 来 ， 以 Roche 公 司 的 454 技 术 、 Illumina 公司的 Solexa 技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术 为标志的高通量测序技

4、术相继诞生 。 虽然高通量测序 技术建立的时间 不长 ， 但发展 非常快 。 已经应 用于基 因组 包括测序和表观 基因组学以 及功能基因 组学研 ， 究的许多方面 。 高通量测序技术已经将人们带到了 真正的高通量测序时 代 ， 这些技术 必将在生命 科学领 域得到广泛的应用 ， 并产生极大的推动作用 。 然而 ， 许 多科研人员仅知道高 通量测序技 术的大概原 理 ， 而对 于该技术在生命 科学领域的 应用却知 之甚少 。 为 此 ， 本文详细阐述了高通量测序技 术的最新进展及其在生 收稿日期 ： 2011-04 -11 修回日期 ： 2011-06 -02 * 山西省青年 科技 研究 基金

5、 （ 2010021030-1） 、 国家自 然科 学基 金 （ 31100235） 资助项目 通讯作者 电子信箱 ， ： wxingchun 163 com； sxaulsc126 com 命科学研究中的 应用 ， 以期使 科研工作者 尽早地了 解 该技术 并将其更好地应用到科研工作中 ， 。 1 高通量 测序技术及其发展现状 高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里 程碑 ， 该技术 可以 对数 百万 个 DNA 分 子进 行 同时 测 序 。 这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全 貌的分 析 成 为 可 能 ， 因 此 也 称 其 为 深 度 测 序 （ deep sequenc

6、ing） 或 下 一 代 测 序 技 术 （ next generation sequencing， NGS） 。 目前 ， 所说的高通量测序技术主 要是指 454 Life Sciences 公 司 、 ABI 公司和 Illumina 公 司推出的 第二 代测 序技 术 以及 Helicos Heliscope 和 Pacific Biosciences 推出的单分子测序技术 。 1 1 第二代测序技术 2005 年 ， 454 Life Sciences 公司 （ 现已被 Roche 公司 收购 ） 首先推出了革命性 的基于焦磷 酸测序法的超 高 通量基因组测序系统 ， 开创了第二代测序

7、技术的先河 。 该技术的原理是酶级联化学发光反应 ： 首先 将 PCR 扩 增的单链 DNA 与引物杂交 ， 并与 DNA 聚合酶 、 ATP 硫 酸化酶 、 荧光素酶 、 三 磷酸腺苷双 磷酸酶 、 底物荧光 素 酶和 5-磷酸硫酸腺苷共同孵育 。 在每一轮测序反应中 只加入一种 dNTP， 若该 dNTP 与模板配对 ， 聚合酶就可 1， 2 3 1 1 1 110 中国生物工程杂志 China Biotechnology 。 Vol 32 No 1 2012 PCR 以将其掺入到引物 链中并释放出 等摩尔数 的焦磷酸 ATP， ATP 技术完全摒弃了上述测序平台所基于的 ， 扩增的信 。

8、 焦磷酸盐被硫酸化酶 转化为 。 CCD 就会促 使氧合 号放大过程 ： 真正达到了读 取单分子 荧光的 能力 ， DNA 具 ， 荧光素的合成并释放可见光 ， 检测后通过软件转 体原理为 首先 将待测 样品随机打断成小片段 poly-dA； ， 化为一个峰值 4 峰值与 反应中掺入 的核苷酸数 目成正 在每个 小 片 段 的末 端 加 上 然 后 将 小 片 段 比 。 此后 ， Illumina 公 司 和 ABI 公 司 相 继 推 出 了 DNA 模板与固定在检测芯 片上的 poly-dT 引物 进行杂 Solexa 和 SOLiD （ supported oligo ligation

9、 detetion） 测 交并精确定 位 ， 并 逐一 加入 荧光 标记的 末端 终止 子 。 序技术 。 它们与焦磷酸测 序法的原 理类似 ， 核心思想 ， 、 ， 都是边合成边测序 （ sequencing by synthesis） ， 即生成新 在掺入了单个荧 光标记的核 苷酸后 ， 、 洗 涤 ， 成像 之 后 DNA 互补链时 ， 要么加入的 dNTP 通过酶促 级联反应 切开荧光染料和 抑制基团 。 洗 涤 、 加帽 允 许下一个 核 ， 催化底 物 激发 出 荧光 ， 要 么直 接 加 入被 荧 光 标 记的 苷酸的掺入 这样通过掺入 。 检测和切除的反复循环 ， 即可实时 读

10、 取 大 量 序 列 随 后 他 们利 用 该 技 术 对 dNTP 或半简并引物 在合成或连接生成互补链时释 放 ， M13 基因组进行重测序 。 M13 噬菌体是一种单链 DNA 出荧光信号 ， 。 通过 捕获 光 信号 并转 化为 一 个测 序峰 。 病毒 ， 基因组全长 ， 6 407 个核 苷酸 。 他们共 获得了 。 28 值 获得互补链序列 信息 ， 由此可见 第二代测 序技术 。 万条序列 开 创了单分子高 通量测序 的先河 ， Pacific Biosciences 这之 后 无需进行电泳 ， 操 作极为简便 这不 但大大节 省了成 。 不久 公司又开发出了另一种单分子 （

11、single molecule real 本和时间 而且可 以在芯片上 进行高通 量分析 该测 ， 测序 技 术 time， SMRT） 单 分 子 实 时 技 术 。 DNA 序技术单次反应可 以对数以百万 计的样品 进行分析 该技术利用单分子技术和 聚合 这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的 。 ， 假 酶 ， 在聚合反应的同时就可以读取测序产物 、 。 SMRT 测 如利用这种方法进行 人类基因组 的测序 ， 。 那么 在数天 序技术在测序速 度 。 读长和成 本方面有着 巨大的优 势 3bp / s， 内就可以完成 而且成本也将大大降低 Illumina ， 和潜力 2013 虽

12、然目前的读取速度为 min 但他们声称将 。 公 司 目 前 拥 有 三 种 测 序 平 台 分 别 为 在 年前实现三 测完人类基因组的目标 从而 HiSeq 2000、 HiSeq 1000、 Genome Analyzer IIx （ http ： / / www illumina com / ） ； ABI 公 司则 主 要是 SOLiD 3 和 又向 大步 1 000 。 美元测定 一个人类基因组的目标迈 出了一 SOLiD 4 两个测序平台 200G 。 HiSeq 2000 ， SOLiD 4 测序平台 单次反 100G 。 1 3 Ion PGM Sanger 测序技术 ， 应

13、可以读取 的数据 而 仅为 ， HiSeq 2000 左右 与 双脱氧 链终止法测序技术相比 上 述测 。 从通量这 个 最 直 观 的 数字 看 来 SOLiD 4 。 领 先 于 ， 序技术在测序 速度和成本方 面都有了革 命性的 变革 ， 。 ， Helico 更 高 的 通 量 就 意 味 着 更 低 的 成 本 利 用 但 是 测 序 仪 的 价 格 非 常 昂 贵 例 如 目 前 HiSeq 2000 ， 以 30 倍的覆盖度对两个人类基因组进行测 1 （ http： / /www BioScience 公司的 HeliScope 测序 仪售价近 百万美 元 ， 序 每 个 基 因

14、 组 的费 用 不 到 万 美 元 这是一般实验室和科研单位所不能承受的 。 2010 年年 illumina com / systems /hiseq _2000 ilmn） 。 ， 454 ， 就 测序 读长 400 nt。 底 ， Life Techologies 公 司 推出 的 Ion Machine （ PGM ） Personal Genome 1 / 来说 ， 454 测序平台读长最长 目前已经达到 ， 因 10， 测 序仪价 格仅 为普 通测 序仪 的 。 Ion PGM 此 平台比较 适合对未知基因组从 头测序 。 Solexa 但是在 很好的解决了这一问题 ， 测序仪的设

15、计是 5 6 8 TM 判断连续单碱基重复区时准确度 不高 454 ， 100nt ， 、 测序读 ， 基于半导 体 芯片 技 术 DNA ， 在 半 导 体芯 片 的 微孔 中 固 定 ACGT。 ， 长较 短 仅为 左右 。 SOLiD 但测序 通量高 ， 价位低 链 随后依次掺入 ， 随着每个 碱基的掺入 。 适合基因组重测序等 读长也较短 但测序精度 释放出氢离子 在它们穿过每个孔底部时能被检测到 ， 、 较高 ， 特别适合 SNP 检测等 。 与其它新一代测序仪相比 ， 。 它不需要激光 照相机或标 、 1 2 单分子测序技术 记 价格当然要便宜很多 这种独特的流体体系 ， 微体 在

16、第二代测序 平台不断完善 和广泛应 用的同时 ， 系机械设计和半 导体技术的 组合 2 h 10Mb 1Gb 使得研 究人员能 够 以对单分子 DNA 进行非 PCR 测序为主要特征的更新 在 内 获 取 从 到 以 上 高 精 确 度 序 列 的 测 序 技 术 也 初 显 端 倪 。 2008 7 年 4 月 ， Helico （ http： / / www iontorrent com / products-ion-pgm /） 。 BioScience 公司的 Harris 等 在 Science 上报道 了他们 1 4 高通量测序技术的优点 开发的 基 于 全 内 反 射 显 微 镜

17、 （ total Internal reflection 高通量测序技术有三大优点是传统 Sanger 测序法 microscopy， TIRM） 的测序技术 单分子测序 技术 。该 所不具备的 。 第一 ， 它利用芯片进行测序 ， 可以在数百 2012， 32（ 1） ， 王兴春 等 ： 高通量测序技术及其应用 ， 2 2 RNA 111 万个点上同时阅读测序 把平行处理的思想用到极致 （ massively parallel 高通量 测序及其在转录组和基因表达调控 因此 也 称 之 为 大 规 模 平 行 测 序 signature sequencing， MPSS） ， 这一点是 大家所

18、熟知的 ， ， 。 ， 研究中的应用 转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发 。 第二 高通量测序技术有完美的定量功能 这是因为样 点 是全基因组 测序完成后 首先要面 对的问 题 最 近 品中某种 DNA 被测序的次 数反映了样 品中这种 DNA 的丰度 。 这一点有望取代以前的基因表达芯片技术用 于基因表达的研究 。 第三 ， 成本低廉 。 利用传统 Sanger 测序法完 成的人类基因组计划总计耗资 27 亿美元 ， 虽 然比预计的 30 亿美元节省了不少 ， 但仍是一个耗资巨 大的工程 。 而现在利用高通量测序技术进行人类基因 组测序 ， 耗资不到传统测序法的 1% 。 2 高通量

19、测序技术的应用 高通量测序技 术的迅猛发展 ， 将基因组学 水平的 研究带入了一个新的 时期 ， 也使经 典分子生物 科学家 对基因组学的认识和思考上升到一个新的水平 。 高通 量测序技术不仅可以 进行大规模 基因组测序 ， 还可用 于基因表达分析 、 非 编码小 分子 RNA 的鉴 定 、 转录因 子靶基因的筛选和 DNA 甲 基化等相关研究 。 2 1 高通量测序技术在全基因组测序中的应用 全基因组测序 对全面了解一 个物种的 分子进化 、 基因组成和基因 调控等有着 非常重要 的意义 。 但 是 ， 高通量测序技术在发 展初期由于 读长较短 ， 使其在对 未知基因组从头测序 （ de n

20、ovo Sequencing） 的应用受到 限制 ， 只能用于基 因组重测序 。 基因 组重测序 是指对 已知基因组序列的 物种进行不同 个体的基 因组测序 ， 并在此基础上对个体或群体进行差异性分析 。 2008 年 4 月 17 日的 Nature 杂志上 ， 美 国的 科学家发表了首个 利用新一代高通量测 序技术得到 的人类全基 因组 ， 这 个基因组正是 “DNA 之父 ”James D Watson 的 。 整 个测序 过 程在 2 个 月内 就 完成 了 ， 花 费不 到 100 万 美元 。 随着高通量测 序技术的不断 完善 ， 独立应 用该技 术进行全 基因组从头 测序成为可能

21、 。 2010 年 1 月 21 日 ， 由深圳华大基因研究院发起 ， 中国科学院昆明动物 研究所 、 中国科学院动物研究所 、 成都大熊猫繁育研究 基地和中国保护大熊猫研究中心参与的大熊猫基因组 测序成 果 以 封 面 文 章 的 形 式 发 表 在 国际 权 威 杂 志 Nature 上 。 这是全球第一个完全使用高通量测序技 术完成的基因组序列图 。 科学家们将高通量测序技术应用于转录组分析开发出 了 RNA 测序技术 （ RNA-Seq） ， 该技术能够在全 基因组 范围内检测 基因 表达 情况 ， 进行 差异基 因筛 选分 析 。 由于 RNA-Seq 技术具有通量高 、 可重复性高

22、 、 检测范围 宽 、 定量 准等特点 已经广泛应用于细菌 ， 、拟南芥 、 水稻 和人类等生物转录组的研究 。 我国在应用 RNA-Seq 进 行水稻转录谱分析方面走在了世界的前列 。 王俊和韩 斌领导的研究小组利用 RNA-Seq 技术分别对水稻的转 录组进行高分辨 率的分析 ， 发 现水稻具有 可变剪切 模 式基因数目远远高于预期 。 转录组研究是从整体水平研究基因功能以及基因 结构 。 但是 ， 多数研究 人员感兴趣 的是某 一特定的 生 物过程 发育 阶段或处理后 的基因表 达情况 、 。 基因 芯 片技术曾在该领 域的研究中 发挥了重要 的作用 ， 但 它 只能检测 已 知序 列

23、的特 征 ， 对 于未 知 的 序列 无 能 为 力 。 而建立在高通量测序基础上的数字化基因表达 谱 （ digital gene expression profiling） 分析无 需预先针 对 已知序列设计探 针 ， 即可对任 何生物整体 转录活动 进 行检测 ， 因此应用范围 更加广泛 。 最近 ， Eveland 等 成功地将数字 基因表 达谱 应用 于玉 米雌 穗发 育的 研 究 ， 并发现了一批调 控花序结构的基因 。 高通量 RNA 测序技 术另一个 广泛应 用的领域 是 小 RNA 的研究 。 小 RNA 在植物的生长 发育和外界胁 、 迫应答等方面具有重要功能 。 但由于小

24、 RNA 序列短 、 同源性高 ， 因此 利用基因 芯片检 测小 RNA 非常 困难 。 高通量测序技术 不但能够克 服这一难题 ， 而且能够 发 现新的小 RNA。 目前 ， 高通量测序技 术已经成功 的应 用于拟南 芥 、 水 稻 和 小麦 等 生 物小 RNA 的 研究 。 2 3 ChIP-Seq 技 术及其在 DNA 和蛋 白质 相 互作 用 研究中的应用 染色质免疫共沉淀 （ chromatin immunoprecipitation， ChIP） 技术是研究体内蛋白质与 DNA 之间相互作用的 强有力工具 ， 在转 录因子结合 位点或组蛋 白特异性 修 饰位点的研究中被广泛应用

25、。 最近诞生的染色质免 疫 共 沉 淀 测 序 （ chromatin immunoprecipitation sequencing， ChIP-Seq） 技术充分 结合了 ChIP 和 高通量 9 9 10 测序技术的优势 ， 能够在全基 因组范围内 高效地研 究 112 中国生物工程杂志 China Biotechnology 29 Vol 32 No 1 2012 目的蛋白 的 结 合 位点 ChIP 。 该技 术 的 原 理 是 ： 首 先通 过 - 序数据的分析却成 为一大难题 。 。 第二 ， 高通量 测序 DNA 技术利 用 抗体 特 异性 地 富 集交 联 的 目 的蛋 白 ；

26、 DNA 技术不适合小规模测序 ， 虽然高通量测序技术的价格 。 ； 复合体 然后再将得到的 片段进行高通量测 不断降低 但 一次反应仍需 几千至数 万元的 花费 PCR 这 ， 序 最后将获得的数百 万条序列标 签精确定位 到基因 ， 对于 产物和质 粒等数十到数千个碱基的 测序 一 组上 从而获得全基因 组范围内与 组蛋白或转 录因子 等互作的 DNA 区段信 息 。 该方法克 服了以往 染色质 免疫共 沉 淀 芯片 - （ chromatin immunoprecipitation chip， ChIP-chip） 技术依赖于实验者选择探针的不足 ， 可以为 任何生物测序 。 2007

27、年 ， 应用 ChIP-Seq 技术获得研 究成果分别发表在 Science 、 Nature 和 Cell 三大 顶级刊物上 。 我们在体细胞胚胎发生的研究中发现了 一个 PGA37 基因 该基因编码一个 ， R2R3-MYB 转录因 子 ， 在植物体细胞胚胎 发生和脂肪 酸生物合成 过程中 起着重要的调 控作用 。 分 离并鉴定 PGA37 的靶基 因是阐明该基因 生物学功能 的关键 。 为此 ， 我们正与 有关测序公司洽谈 ， 利用 ChIP-Seq 技术来 筛选 PGA37 的靶基因 。 2 4 高通量测序技术在基因组 DNA 甲基化分析中的 应用 DNA 甲基化在维持细胞正常功能 、

28、 遗 传印记和胚 胎发育过程中起着极其重要的作用 。 新一代高通量测 序技术使得基因组整体水平高精度 的甲基化检测成为 现实 。 目前 ， 已 经建立了至 少三种依 赖于高通 量测序 的 DNA 甲基化分析技术 ： 甲基化 DNA 免疫共沉淀测序 （ methylated DNA immunoprecipitation sequencing， MeDIP-Seq） 、 甲 基 结 合 蛋 白 测 序 （ methyl-binding protein sequencing， MBD-Seq ） 和 亚 硫 酸 氢 盐 测 序 （ bisulfite-sequencing， BS-Seq） 。 它

29、们之 间的区别在 于前 两 种方 法 首先 通 过特 异 性结 合 甲基 化 DNA 的 MBD2 b 或 5 -甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的 DNA， 然 后再对富集到的片段 测序 ， 而第三 种方法不经 过富集 直接测序 。 虽然 MeDI P- Seq 和 MBD-Seq 都是基于富 集的原理 ， 但二者是相辅相成的策略 。 MeDIP-Seq 对高 度甲基化和高密度的 CpG 更加敏感 ， 而 MDB-Seq 对高 度甲基化和中等 CpG 密度更加敏感 。 目前 ， 高通量 测序技术已经广泛应用 于拟南芥 、 水稻 、 蚕 和 人 等 生 物 DNA 甲 基 化 的 研 究 ， 并 取

30、得 了 丰 硕 的 成果 。 3 高通量测序技术存在的问题及其发展趋势 尽管高通量测 序技术有诸多 的优势 ， 但其 局限性 也不容忽视 。 第一 ， 测序速度提高了 ， 但后续的海量测 19 20 21 22 23 24 25 26 25 27 28 26 般客户将 是很难接受的 ， 这时传统 Sanger 测序法 无疑 还是最佳的选择 。 最后 ， 新一代测序仪价格昂贵 ， 动辄 几百万元 ， 一般 的小 型实验 室难 以承 受 。 因 此 ， 传 统 Sanger 将与高通量测序技术长期并存 ， 在短期内还不会 被 淘汰 。 另外 高通量测序技术只是研究的开端 ， ， 现 在我们所能解释

31、 的生物学现 象和机制还 很有限 ， 即 使 获得了基因组信息 ， 如何去解释和应用它 ， 仍是一个长 远的问题 。 测序技术 的发展日新月 异 ， 本文所述 的焦磷酸 测 序等测序平台都依赖生物化学反应 。 这不但加大了测 序成本 ， 而且浪费了时间 ， 不利于测序速度的提升 。 因 此 ， 非光学显微镜成像 、 纳米孔和生物孔等直接测序技 术是未来的发展方向 。 相信随着高通量测序成本的 进一步降低和对 海量数据处 理能力 的不 断提高 ， 高 通 量测序将成为一 项常规的实 验手段 ， 并为 生物学和 生 物医学研究领域带来革命性的变革 。 参考文献 1 Mardis E R Next-

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