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1、生物多样性 2007, 15 (3): 306311 doi: 10.1360/biodiv.070069 Biodiversity Science http: /www.biodiversity- 综述 土壤微生物多样性影响因素及研究方法 的现状与展望 周 桔 雷 霆 1 (中国科学院资源环境科学与技术局 , 北京 100864) 2 (中国科学院研究生院 , 北京 100049) 摘 要 : 土壤微生物是土 壤生态系统的重要组成部分 , 在土壤有机物质分解和养分释放、能量 转移 等生物地化循环 中 起着重要作用。随着人们对生物多样性 重要性认识的不断深入及研究方法的不 断改进 , 土壤微生
2、物多样性 , 尤 其是功能多样性的研究工作逐渐受到生态学家的重视。本文从土壤微生物多样性的影响因素以及研究方法等方面 阐述了目前国内外土壤微生物多样性的研究现状 , 并对其未来研究方向进行了展望。 关 键词 : 生物多样性 , 微生物 , 土壤 Review and prospects on methodology and affecting factors of soil mi- crobial diversity Ju Zhou , Ting Lei 1 Bureau of Sciences and Technology for Resources & Environment, Chine
3、se Ac ademy of Sciences, Beijing 100864 2 Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 Abstract: Soil microorganisms are important components of soil ecosystem and play central roles in bio- geochemical cycling such as organic matter decomposition, mineral nutrient release,
4、 and energy transforma- tion. Along with the intensive comprehension of the importance of biodiversity and the rapid development of methodology, more and more studies have focused on soil microbial diversity. This review introduces the current development of methodology and affecting factors of soil
5、 microbial diversity. We also discussed the directions of future research on soil microbial diversity. Key words: biodiversity, microorganisms, soil 土壤生态系统中的各种生物相互作用 , 形成复 杂的土壤食物网 , 正是这些土壤生物的活动 , 使土 壤生态系统具有各种各样的生态服务功能。由于土 壤中微生物数量庞大 , 作用复杂 , 在土壤生物的研 究中占据重要地位。土壤微生物包括原核微生物如 细菌、蓝细菌、放线菌及超显微结构微生物 , 以及 真 核
6、 生 物 如 真 菌 、 藻 类 ( 蓝 藻 除 外 ) 、 地 衣 等 (Jenkinson & Ladd, 1981)。它们是土壤有机质 (C)和 土壤养分 (N、 P 等 )转化和循环的主要推动力 , 并参 与腐殖质形成等生化过程 , 在土壤生态系统中起着 非常重要的作用。 收稿日期 : 2007-03-09; 接受日期 : 2007-05-08 基金项目 : 国家自然科学基金重大研究计划资助项目 (90211017) * 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: 近年来由于人口的增加、自然资源 的过度开 发、环境污染的加剧以及外来物种的入侵 ,
7、土壤生 物多样性受到了强烈的干扰 , 许多土壤生物类群 的多样性降低甚至消失。因而 , 生物多样性在维持 土壤质量、维护陆地生态系统的稳定和健康方面的 重要作用日益引起人们的关注。由于土壤微生物的 复杂性、土壤本身的多变 性和研究方法不完善等原 因的限制 , 以往人们对土壤微生物多样性的研究 与动、植物相比远远落后。随着现代生物学尤其是 多聚酶链反应 (PCR)、核酸测序等分子生物学技术 的迅速发展 , 人们对土壤微生物多样性有了更深入 1,2* 2 1, 2* 2 第 3 期 周桔和雷霆 : 土壤微生物多样性影响因素及研究方法的现状与展望 307 的了解。同时 , 也有 越来越多的学者加入到
8、土壤微 生物多样性的研究和保护中来。 1 土壤微生物多样性影响因素 影 响土壤 微生物 群落的 结构组 成和多 样性 , 尤其是其功能多样性的因素有很多种 , 可大体分 成自然因素和人为因素两大类。自然因素包括植 被、土壤类型、温度、水分以及 pH 值等；人为因素 包括农药、施肥以及土壤耕作方式等人类对土壤的 管理方式。下面就植被、土壤类型、温度和水分、 土壤管理方式几种有代表性的土壤微生物多样性 影响因素分别加以阐述。 1.1 植被 植被通过影响土壤有机碳和氮的水平、土壤含 水量、温度、通气性及 pH 值等来影响土壤微生物多 样性。植被是土壤微生物赖以生存的有机营养物和 能量的重要来源 ,
9、影响着土壤微生物定居的物理 环境 , 如植物凋落物的类型和总量、水分从土壤表 面的损失率等。植被的存在有利于增加土壤微生物 多样性和微生物生物量；反之 , 植被的破坏可能改 变微生物组成并降低微生物多样性。 Zak 等 (2003) 采用 PLFA 方法研究了植物种类多样性与土壤微生 物的关系 , 结果表明 PLFA 的含量与植物种类数量 相关性显著 , 随着植物多样性的增加 , 土壤中细菌 和放线菌的 PLFAs 数量降低 , 而真菌的 PLFAs 却增 加。 Johnson 等 (2003)的研究表明 , 在北美草原 , 可 能由于土壤中的菌根真菌对不同植物的影响不同 , 使得植物多样性发
10、生变化。 根际 (rhizosphere)指包围并受植物根系影响的 土 壤 区域 。 研究 表 明 , 植物 多 样性 与 根 际土 壤 (rhizospheric soil) 微 生 物 的 关 系 十 分 密 切 (Kowalchuk et al., 2002)。植物根系及其分泌物为土 壤微生物提供生长基质和有利的生长环境 , 而 植物 本身则从微生物对根系的分泌物和其他土壤有机 和无机物质的转化所带来的养分释放中获益。因此 , 研究植物根际土壤微生物多样性变化是研究植物 与 土壤 微 生物 之间 关系 的重 要 问题 之一 。应 用 Biolog 微平板法 (Crayston et al
11、., 1998)、 16S rRNA 分 析 (Kaiser et al., 2001)、 PCR-DGGE(Smalla et al., 2001)等方法开展的研究都证明不同植被类型、同一 植物不同基因型间 (Di Giovanni et al., 1999; Arab et al., 2001)、同一基因型不同发育阶段 (Picard et al., 2000; Marschner et al., 2001)的根际土壤微生物多样 性均有不同。上述研究结果表明植物根际土壤微生 物多样性不仅随着植物类型改变 , 还随着植物的生 长发育过程改变 , 具有非常强的时空特征。 不同植物物种根系分泌物
12、 (root exduates)的化 学组成及根系周转 (root turnover)速率通常 存在差 异 , 因而外来植物取代土著植物后会改变 根系对土 壤的营养物质输入 , 从而影响土壤微生物的结构与 功能 (Kourtev et al., 2002)；外来植物与土著植物凋 落物数量和质量的变化也会影响土壤微生物多样 性 (Saggar et al., 1999)。此外 , 外来植物会改变其入 侵地土壤的水分状况及土壤结构等物理特性 , 从而 间接 地影响 土壤微 生物 的多样 性 (Kourtev et al., 2002)。 土壤微生物与植物间的相互作用推 动着生态 系统功能的变 化
13、, 如植物群 落多样性、生产力 等 (Klironomos, 2002)。因此 , 植物与土壤微生物群落 的关 系是 复杂 的综合 作用 的结 果 (Orwin et al., 2006)。 1.2 土壤类型 近年来大量实验都证明了土壤类型 是土壤微 生物群落结 构和密度的 主要影响因 素 (Chiarini et al., 1998； Gelsomino et al., 1999; Da Silva et al., 2003)。 Yang 等 (2000)研究了土壤有机碳与土壤微生 物功能多样性的关系 , 结果表明 , 两者之间存 在明 显的相关性 , 维持土壤有机碳含量对保持微生物多 样性
14、很重要。 Sessitsch 等 (2001)用 T-RFLP 技术研究 了长期不同施肥条件下的土壤颗粒中微生物多样 性 , 结 果表明土壤颗粒越细小 , 有机质含量越高 , 土壤颗粒中的 微生物群落结构越复 杂 , 多样性 越 高。 Staddon 等 (1998)对加拿大西部不同气候带的土 壤微生物多样性和结构进行了研究 , 结果表明土壤 微生物功能多样性与土壤 pH 值呈正相关 , 但随纬 度增加而降低。 ODonnell 等 (2001)研究也发现 , 土 壤 pH 值是影响土壤微生物多样性的重要因子。 1.3 温度和水分 温度和水分对土壤微生物多样性的 影响存在 交互性 , 具有协同
15、效应 (周才平和欧阳华 , 2001), 因 此可以用季节的概念来说明不同温度和水分对微 生 物多 样 性 和 活性 的 影 响 (Papatheodorou et al., 2004)。例如 , Liu 等 (2000)用 Biolog 分析方法证明 , 在 美国新墨西哥州北部 Chihuahuan 沙漠牧场中微生物 308 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 15 卷 的功能多样性在夏季最高 , 春季最低；在夏季干旱 试验 区比在夏季和 春季的对照中 更低； Lipson 和 Schmidt(2004)对高山冻 土土壤细菌群落 的研究结 果表明 , 细菌群落结
16、构组成具有季节性变化规律； Schadt 等 (2003)对苔原冻土土壤中真菌群落结构的 研究表明 , 从 冬季到夏季 , 子囊菌 (Ascomycota)所 占 比 例 下 降 , 担 子 菌 (Basidiomycota) 和 结 合 菌 (Zygomycota)比例上升。 Nemergut 等 (2005)对高山和 北极地区土壤微生物的研究综述中指出 , 夏季温度 高 , 植物代谢旺盛 , 向土壤中释放一些根际分泌物 而刺激细菌繁殖；到了秋季植物停止生长 , 微生物 以能利用植物凋落物的真菌为主；再到了冬季 , 适 寒性微生物则大量繁殖。 1.4 管理方式 土壤的管理方式包括农药的应用、
17、施肥、耕作 方式等 , 这些人为的影响因素通过改变土壤的理化 性质而影响微生物多样性。 农药包括除草剂、杀真菌剂和杀虫剂等 , 不同 农药对土壤微生物的影响不同 , 可能对土壤微生物 产生不同程度的抑制作用 , 也可能使土壤微生物多 样性和生物量减少 , 还可能使土壤微生物群落结构 和 功 能 发 生 改 变 ( 钟 文 辉 和 蔡 祖 聪 , 2004a) 。 Fantroussi 等 (1999)研究了经敌草隆 (diuron)、利谷隆 (linuron)和绿 麦隆 (chlorotoluron)3 种脲除 草剂处理 10 年后 的土壤中微生物群落的变化 , 结果表明 , 使 用除草剂后
18、, 土壤微生物多样性降低 , 其群落结构 和代谢能力受到明显影响； Sigler 和 Turco(2002)用 PCR-DGGE 法对杀菌剂百菌清在草坪、森林和农业 土壤上的应用研究结果表明 , 百菌清使土壤细菌和 真菌的群落结构都发生改变；杀虫剂也可能影响土 壤微生物多样性和活性 , 如 Yang等 (2000)对杀虫剂 triadimefon 的研究表明 , 杀虫剂在 DNA 水平上影响 土壤微生物群落多样性 , 且受杀虫剂污染的土壤的 有机碳含量和微生物生物量 中碳含量都较低。 施肥对土壤微生 物多样性及活性的影响非常 复杂 , 可能与肥料的种类、施用方式 (施用量、长期 施用或短期施用
19、 )、土壤类型和利用方式等因素有 关。 Marschner 等 (2001)的实验结果表明 , 长期施用 有机肥使得 G+/G和细菌 /真菌的比例提高 , 细菌和 真核微生物群落多样性受土壤有机碳和 C/N 比的影 响；而 Sun 等 (2004)的实验结果则是：自然的和经过 有机肥处理的土壤微生物群落多样性相似 , 但是与 化肥处理的差异明显 , 石灰处理对多样性的影响较 小。 Sarathchandra 等 (2001)认为无机氮肥和磷肥对土 壤微生物多样性无明显影响。 土地耕作方式包括传统耕作、免耕、连作、轮 作等 , 不同的耕作方式会对土壤微生物多样性造成 不同的影响。有较多报道认为
20、, 免耕土壤中的微生 物多样性和生物量均高于传统耕作后的土壤 , 其原 因是传统耕作会导致土壤团聚体的分裂和表层土 壤中有机质的消耗 , 而已发现的大团聚体中的微生 物生物量比微团聚体中的高 , 减少耕作能增大团聚 体 , 使微生物多样性和生物量增加 (Lupwayi et al., 2001; Feng et al., 2003)。 Alvey 等 (2003)的实验证明 谷物 / 豆科植物轮作对根际微生物群落结构有显著 影响 , 在连续种植谷物的土壤中生长的植物有较相 似的根际细菌群落 , 而轮作土壤中的微生物群落则 出现 较大 的变 异性 。 Olsson 和 Alstrom(2000)
21、应 用 FAME 图谱对大麦连作和轮作对土壤微生物群落结 构的影响进行研究 , 结果表明 , 从连作和轮作处理 土壤中分离出的细菌菌株 FAME 图谱不同 , 表明土 壤微生物多样性发生了改变。 Bnemann 等 (2004)对 5 年玉米连作、玉 米 猪屎豆轮作和磷肥用量用 PLFA 法进行研究 , 结果表明轮作促进了真菌和 G细菌 的生长；磷肥对微生物群落结构的影响只有在连作 时才表现出来；轮作处理作用效果大于磷肥处理。 2 土壤微生物多样性研究方法 根据研究技术类型 , 土壤微生物多样性的研究 方法大体上可分为两类：基于生物或化学的方法和 基于现代分子生物学技术的方法 (钟文辉和蔡祖聪
22、 , 2004b)。生物或化学方法包括传统的平板计数法、 荧 光 染色 法 、 Biolog 微 平 板 分析 、 磷 脂 脂 肪 酸 (phospholipid fatty acid, PLFA)谱图分析方法、脂肪 酸甲酯 (fatty acid methyl esters, FAME)谱图分析方 法等。分子生物学方法可归纳为三方面：一是基于 分子 杂 交 技术 的 分子 标 记 法 , 如 荧 光 原位 杂 交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)、同位素标 记技术等 , 可对微生物在特定环境中的存在与否、 分布模式及丰度等情况进行研究 ,
23、具有较高的灵敏 性和特异性。二是基于 PCR 技术的研究方法 , 这些 方法可以将极微量的 DNA 进行大量扩增 , 通过比较 分析基因序列的特异性来研究微生物的多样性。如 随机扩增多态性 DNA 技术 (random amplified poly- 第 3 期 周桔和雷霆 : 土壤微生物多样性影响因素及研究方法的现状与展望 309 morphic DNA, RAPD)、扩增片段长度多态 性技术 (amplified fragment length polymorphism, AFLP)、限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 技 术 (restriction fragment length
24、polymorphism, RFLP)和末端限制性片段长度 多态技术 (terminal restriction fragment length poly- morphism, T-RFLP) 、 单 链 构 象 多 态 性 技 术 (single-strand conformational polymorphism, SSCP)、 变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electro- phoresis, DGGE)和温度梯度凝 胶电泳 (temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)、核糖体基因间 区分析 (ri
25、bosomal intergenic spacer analysis, RISA) 等。三是基于 DNA 序列测定的研究方法 , 分析具体 碱基序列的突变情况 , 通过与生物信息学结合 , 进 行数据比较分析 , 找出微生物多样性的遗传进化线 索 , 如元基因组 (metagenome)测序技术 , 成为对难 培养微生物或不可培养微生物的系统发育和功能 研究的重要方法。 根据分析对象范围 , 土壤微生物多样性的研究 方法大体上可分为两类：一类是用于分析土壤中可 培养的微生物群落；另一类是用于分析土壤中整个 微生物群落 (Nannipieri et al., 2003)。第一类分析方 法基于微生
26、物的形态判别和微生物的脂肪酸甲酯 谱等。第二类则不需要培养微生物 , 包括群落水平 的 生理 特 性分 析、 磷脂 脂肪 酸 方法 和核 酸分 析 (nucleic acid-based analysis)等方法。 从研究的层次上划分 , 土壤微生物多样性的研 究方法大体上可分为三类：遗传多样性、物种多样 性和功能多样性。微生物遗传多样性主要通过分子 生物学 技术 , 从分 子水平上研究土壤 微生物多样 性；微生物物种多样性主要从对微生物类群即细 菌、真菌和放线菌这三大类群的数量及其比例组成 来描述微生物多样性 , 或者按照微生物在生态系统 中的作用将其划分成不同的功能群 (function
27、group), 通过某一功能群中物种的分类及其数量来研究土 壤微生物多样性 (Nannipieri et al., 2003), 如对土壤 中的产甲烷细菌 (Mer & Roger, 2001)、固氮菌、根 瘤菌、菌根菌等的多样性进行研究；土壤微生物功 能多样性指包括微生物活性、底物代谢能力及与 N、 P、 S 等营养元素在土壤中转化相关的功能等 , 通过 分析测定土壤中的一些转化过程 , 如有机碳、氮矿 化速率、土壤氮固持率、硝化作用以及土壤中酶的 活性等 (Louise et al., 2000)来了解土壤微生物功能 , 如对碳源利用功能分析时常用 Biolog 微平板法。 上述各种方法应
28、用范围不同 , 精度也不同 , 各 有优缺点 (Nannipieri et al., 2003; 张洪勋等 , 2003; 钟文辉和蔡祖聪 , 2004b)。因为环境中大多数微生物 处于“存活但不能培养的状态” , 因此传统培养法 有很大局限性 , 难以准确研究微生物多样性与其生 态功能的关系 , 精度差；磷脂脂肪酸和脂肪酸甲酯 分析方法主要应用于微生物群落动态变化的定量 分析 , 精度一般 , 虽然能够快 速有效地从环境样品 中提取大部分脂肪酸 , 但只能鉴别到属的水平 , 且 受人为因素干扰强烈； Biolog 微平板法主要用于异 养微生物群落结构多样性的研究 , 操作快速简便 , 但精度
29、一般 , 只能鉴别能在 Biolog 系统内生长的微 生物 , 其结果受到培养环境的强烈影响；荧光原位 杂交用于分析原核微生物的群落结构 , 精度高 , 但 其应用受到环境样品微生物的生理状态的影响 , 而 且事先要根据已知种属设计探针 , 不能检测出环境 样品中的未知种属；近年来兴起的基于 PCR 技术的 分子生物学研究方法如： RAPD、 AFLP、 RFLP、 SSCP、 TGGE、 DGGE、 RISA 等技术已经较为成熟 , 能鉴定出大部分土壤微生物 , 且精度高 , 目前被广 泛应用于微生 物生态学研究 , 但这些方法也有 不 足： (1) 每次核酸提取的效率不同 , 造成结果可重
30、复 性差。 (2)引物对不同样品的扩增效率不同 , 引起丰 度估计偏差。 (3)由于对真核生物核糖体的编码基因 及复杂调节机制的研究还不透彻 , 目前在真核微生 物生态学的分析中应用得还较少。因此 , 将多种技 术综合使用可避免由于方法原理本身所带来的不 可避免的偏 差 , 可提供更加全面准确的微生物多样 性变化的信息。 3 土壤微生物多样性研究展望 随着人们对土壤微生物多样性研究 的不断深 入 , 今后的研究工作将集中在如下四个方面： (1)新技术新方法的应用。随着分子生物学技术 的发展 , 目前的新型技术如 DNA 芯片技术、环境全 基因组测序技术和稳定同位素标记技术等 , 为土壤 微生物
31、多样性研究提供了新的方法 , 从而能将微生 物在基因层面上所发生的变异与环境因子相结合 , 为土壤微生物多样性功能与生态系统平衡以及各 功能群落结构之间关系的研究提供有力的支 持。 (2)各种研究方法有机结合。目前对单一方法的 310 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 15 卷 研究已经基本成熟 , 今后有必要加强对各种研究方 法的灵活应用 , 根据各种方法的优缺点将其有机结 合 , 取长补短 , 消除单一方法的误差 , 提供更加全 面准确的微生物多 样性变化信息。 (3)对土壤微生物功能多样性和功能群的研究。 土壤微生物功能多样性与土壤功能关系密切 , 土壤
32、微生物功能多样性是土壤功能的保证 , 同时也是恢 复土壤功能的基础。迄今为止 , 研究较多的功能多 与 C、 N、 S 等元素的物质循环和污染物降解过程相 关 , 其他生态过程 (例如磷循环 )的相关功能研究结 果则很少。而微生物多样性研究的一个明显的趋势 是将微生物的功能多样性提到了更为突出的位置 , 在物种尺度之上 , 更强调功能群的划分 , 围绕某一 土壤生态功能群开展研究正成为土壤生物多样性 研究的重 要趋势。 (4)将微生物多样性与地区、区域及全球范围的 生态学动态分析结合起来。目前人们所能了解的详 细的群落多样性信息大部分来自于几类易于研究 的群落类型如农田、森林、草地生态系统 ,
33、 岩岸潮 间带 , 温带湖泊等。而对其他类型群落及其相互作 用结合起来进行研究 , 将为我们了解微生物群落结 构的普遍模式提供重要帮助。因此 , 微生物多样性 与地区、区域及全球范围的生态学动态分析相结合 ; 扩大微生物多样性研究的群落范围将成为未来微 生物多样性研究的热点。 参考文献 Alvey S, Yang CH, Buerkert A, Crowley DE (2003) Ce- real/legume rotation effects on rhizosphere bacterial community structure in west African Soils. Biology
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