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1、第十一章,基因工程与基因体外表达,重组DNA技术定义,重组DNA技术是按照人们的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增、繁殖以获得DNA分子的大量拷贝。 所谓克隆是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。由于重组DNA技术实验是对基因操作，故又称为基因克隆或DNA克隆，同时由于这类克隆在分子水平上操作，又称为分子克隆。,重组DNA技术的重大意义,重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；重组DNA技术缩短了进化时间；重组DNA技术使人能对生物进行定向改造。,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,克隆基因的表达及检测纯化,限制性核酸内切酶,是一
2、类能识别和切割DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶命名:以限制性内切酶来源的微生物学名进行命名。通常第一字母（大、斜）代表该酶的微生物属名；第二三字母（小、斜）代表微生物的种名；第四个字母代表寄主菌的株或型；,类：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两 种功能，但识别、切割位点不一致；类：有核酸内切酶和甲基化酶功能，但在DNA链上特异切割点在识别位点以外；类：能识别切割双链DNA特异序列，产生特异的DNA片段；,限制性核酸内切酶的分类,1、产生平末端：在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。,类内切酶切割形成端口类型,Hind,2、产生5端突出的粘性末端：在识别顺序的双侧末端切割DNA双链
3、，于对称轴的5末端切割。,Bam H,5,3,3,5,3、产生3端突出的粘性末端,Sac,5,3,3,5,同功异源酶 来源不同的限制酶，识别顺序相同，切割位点可以相同也可以不同，这些酶称同功异源酶。,少数有特殊性质的型酶,Bam H,Bst,Kpn ,Asp718,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。,同尾酶,Bam H,Bg l,+,+,这种酶识别位点与切割位点不一致，但其切割与识别位点距离是一定的，一般为10个碱基。,远距离裂解酶,可变酶,它们的识别序列中1个或几个核苷酸是可变的。一般识别序列大于6个碱基,类限制性内切酶操作注意事项,1、
4、防止污染，限制酶的量不应超过总量的10%。2、整个操作过程在0进行，一般总是加完其他试剂后，最后加酶。3、酶应分装成小份存储。4、当DNA需要两种以上的酶切时，最好是使用同种缓冲液。,(二)重组DNA技术中常用的工具酶,基因克隆需要特定DNA载体,载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞，进行扩增和表达的工具。其本质是DNA。用于克隆和扩增特定的DNA片段的载体称克隆载体，用于表达外源基因的称为表达载体。 载体应具备以下特征： 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2.至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入
5、宿主细胞,1. 质粒 (plasmid),特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,质粒是存在于细胞染色体外的小型双链DNA分子,2-200Kb之间.本身含有复制功能的遗传结构,能在宿主细胞独立自主进行复制,并在细胞分裂时,保持恒定地传给子代细胞.,缺点:该载体一般只能接受小于15kb的外源DNA片段.插入 过大,会导致重组体扩增减慢,甚至插入片段先进丢失.,质粒载体-pBR322,4.3kb多拷贝松弛型，内含一个（Ori)、一个抗氨苄青霉素（Ampr ）和一个抗四环素（Tetr ）标记基因，在Ampr 中有两个内切酶位点（PstI、PvuI)，在Tet
6、r 中有三个内切酶位点（EcoRV、BamHI、SalI)。,目 录,PUC系列质粒是由pBR322质粒中的氨苄青抗性基因、复制起始点与大肠杆菌lacZ基因片段改建而成的.,1）抗性标记基因 a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Kanr， b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: 抗除草剂基因2）营养标记基因 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。,标记基因的种类,3）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ。 半乳糖苷酶基因有1021
7、 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。,LacZ基因的结构与产物,筛选重组子的示意图,利用菌落颜色筛选重组子,噬菌体是一类细菌病毒,有双链噬菌体和单链噬菌体两大类.前者为噬菌体类,后者包括M13噬菌体和f1噬菌体. 噬菌体由于能够携带外源DNA较大,而且感染能力也大于质粒转化细菌的能力,所以噬菌体一直被
8、作为基因组文库和cDNA文库的克隆载体. M13噬菌体曾被广泛用于制备单链DNA以进行DNA序列分析和体外定点突变.自从DNA测序列仪和PCR技术出现,代替M13噬菌体在测序和定点突变中应用.目前用于克隆和测序用的PUC载体就是利用质粒和M13噬菌体改造成的.,2. 噬菌体(phage) 载体,噬菌体载体,噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。噬菌体基因组为长度为 48.5kb 的双链 DNA 分子，在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈线性，其两端的 5 末端带有 12个碱基的互补单链（粘性末端）， 12 个碱基的序列为 5-GGGCGGCGACCT-
9、3。当噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，噬菌体可选择进入裂解生长状态或者进入溶源状态。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点,噬菌体基因组全长48.5KB,至少可编码 60多个基因，它们的分布和排列与其功能有一定关系，根据执行功能的不同可将基因组分为三个区。左边区域:其产物用于噬菌体 DNA 的包装和噬菌体颗粒的形成，中间区域:编码基因调节、溶源状态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因，其中许多基因对裂解生长是非必须的，在构建载体时可以去掉，用外源 DNA 片段替代。中间区域占总基因组全长的40%.右边区域:包含噬菌体复制和裂解宿主菌所必
10、须的基因。,这样利用噬菌体基因组中大约40%非必需区域，从而插入外源DNA，成为置换型载体。插入DNA大小为9-23Kb,只有重组的噬菌体基因组DNA在野生型的75-105%之间,才能被包装成噬菌体颗粒. 同时,如无外源DNA取代,由于噬菌体基因组太小,而不能包装,这可以做了挑选重组噬菌体的阳性标志。,代表性噬菌体载体,gt10 载体:可携带6KB的外源基因 利用该载体携带有c基因，其表达的阻遏蛋白，可使噬菌体以溶源状态生活，故形成混浊噬菌斑。同时载体携带的基因 c 内的 EcoR 位点，可用于外源 DNA 片段的插入。重组后的 gt10 变为 c-， c基因不表达，重组噬菌体可使大肠杆菌形成
11、透明斑点。,插入型载体：gt10 载体、 gt11 载体置换型载体：EMBL3 和 EMBL4,gt11 载体： 该载体最大的特点是在最左侧可替代区置换了一段 lacZ 基因，可编码 b-半乳糖苷酶，在 IPTG/X-gal 平板上形成兰色噬菌斑。 同时lacZ 基因编码区终止密码子之前有一个 EcoR 位点，可用于外源 DNA 片段的插入，筛选时，在 lac- 宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源 DNA 片段与 lacZ 的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子。,置换型载体可携带9-23KB外源基因,这两个载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为
12、20kb、 9kb 和 14kb 。图 3-12 是其结构示意图。从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。,野生型 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感（sensitive to P2 interference）。如果 噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam ，同时带
13、有 chi 位点，并且宿主菌为 rec + ，则可以在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好，噬菌体的这种表型称作 Spi- 。因此，通过噬菌体载体 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。,Spi 筛选,粘性质粒,是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。由入DNA c o s区与质粒重组建造而成.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。cosmid的构造特点:(1)含有抗药标志和自主复制起始部位。(2)一个或多个单一酶的限制位点。(3)带有入噬菌体粘性末端。这一末端是体外包装系统必不可少的成分，
14、所以它可以像入噬菌体一样进行体外包装。(4)分子小，约46kb，可容纳大至40-50kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因文库特。另外，由于非重组体cosmid很小，不能在体外包装,因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。,考斯质粒的优点1) 能象-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞2) 可以装载比质粒或-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA。,3) 由于携带质粒的选择标记，便于筛选4) 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。,M13 噬菌体,M13 噬菌体的基因组为单链 DNA
15、 ，由 6407 的碱基组成。 M13 噬菌体感染细菌后，其基因组经过复制转变成双链，称为复制型，复制型M13在细胞内拷贝数积累到100-200后，DNA合成变得不对称，只有其中一条链进行复制，产生大量单链DNA，并被包装成成熟的噬菌体颗粒，从细胞中排出。,最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链。用途：（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序（2）用于单链DNA的定点诱变（3）用于合成探针,M13噬菌体作为载体的优点及用途,整合型（integrated）载体：即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40PSV系列和
16、逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。,病毒载体,表达载体,指用来在受体细胞中表达外源基因的载体称为表达载体。表达载体除具有克隆载体所具备的性质外，还带有转录和翻译所必需的DNA序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如原核表达载体、真核表达载体。,原核表达载体,在原核表达载体中除含有复制起始点、抗性基因、多克隆位点等与克隆载体一样之处外，还必需含有启动子、核糖体结合位点
17、、转录终止序列等表达元件。,（一）、启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T A T A T T A,-10 区,原核生物保守序列,RNA-pol辨认位点(recognition site),全酶,原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的双启动子) 、 PL( 噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。,1、乳糖启动子结构示意图,2、色氨酸启
18、动子,3、trp-lac启动子（Tac启动子）,Tac启动子是由trp启动子加上Lac操纵子中的操纵元件、和SD序列融合而成。整个启动子受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。,4、 PL启动子：,lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物cIts857。在低温(30)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(42)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。,5、T7噬菌体启动子,它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，其转录效率非常高。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶，如JM109。,（二）
19、、SD序列-是外源基因在原核 细胞翻译必需的,在mRNA起始AUG密码上游约8到13核苷酸部位,存在一个4到9个核苷酸的一致序列:AGGAGG我们称S-D序列,而在小亚基16S-rRNA3端有一富含UCCUCC序列,通过与mRNA的S-D序列结合，使mRNA与小亚基结合.,（三）、转录终止序列保证外源基因 高效表达,在原核表达载体中，如果载体中没有转录终止序列，也可以表达某基因的蛋白产物，但并非所有外源蛋白质的表达都可获得满意效果，所以多数表达载体中都带有转录终止序列。,真核表达载体适合在真核细胞 中表达外源基因,如果将真核基因放入原核细胞中表达产生蛋白质时，原核系统就表现出许多缺陷：没有真核
20、转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因；没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体（inclusiion body），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。,要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然应比原核系统优越，常用的酵母、昆虫、动物和哺乳类细胞等表达系统。真核表达载体至少要含两类序列：原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌
21、中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。,第三节 DNA重组技术过程,1、制备目的基因和相关载体2、将目的基因和有关载体进行连接3、将重组本DNA导入受体细胞4、DNA重组体的筛选和鉴定5、DNA重组体的扩增、表达和其他研究,目的基因序列的来源和分离,一、基因组DNA文库
22、采用限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一片段都与一个载体分子拼接成重组体DNA，将所有重组体DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。,二、cDNA文库将某一时间某一种类细胞中所有的cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA分子引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称为cDNA文库。,三、聚合酶链式反应（PCR）TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个
23、非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中 。,四、人工化学合成,二、载体的选择与制备,噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组文库，pUC系列等质粒适合构建cDNA文库和克隆一些较小的DNA片段，M13噬菌体则用于克隆一些待测序的DNA片段。 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基因是要表达的，则要选择合适的表达载体。,三、重组体的连接,1、粘性末端的连接2、利用人工接头连接3、加入同聚物尾连接4、平端连接,四、将重组体DNA分子导入宿主细胞,1、转化指
24、将质粒或其它外源DNA导入感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。2、感染以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当细胞，并在细胞内扩增。,3、转染指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。转染方法：1、磷酸钙共沉淀法2、电穿孔法3、DEAE-葡聚糖法4、脂质体介导基因转染5、显微注射法,四、重组DNA导入细胞后的筛选与鉴定,1、采用遗传学方法筛选特定的重组DNA,(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(marker rescue),(插入失活法)抗药性标记选择,目 录,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无
25、组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,目 录,若克隆基因的表达产物与宿主菌的营养缺陷互补,那么就可以利用营养突变菌株进行筛选,这就是标志补救., 互补的检测,目 录,2、免疫学方法利用特异性抗体检测表达产物,3、核酸杂交法筛选特定DNA,鸡的肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法,目 录,原位杂交,目 录,Southern印迹,目 录,4、PCR技术对特定DNA进行直接鉴定5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNA,hMLCK重组质粒酶切图谱分析1未酶切质粒 2. EcoR酶切 3. Hind 酶切 4EcoR/Hind 双酶切 5. 250bpDNA La
26、dder,1、利用TK-细胞突变株进行筛选,转染细胞的抗性标记筛选,TK-细胞,TK+细胞,HAT培养液,不能存活,能存活,A：氨基蝶呤是核苷酸从头合成的抑制物，H：次黄嘌呤可以作为补救合成dATP、dCTP 的底物T：胸苷它必需在TK（胸苷激酶）作用下生成胸苷一磷酸。,2、药物筛选：新霉素抗性基因G418是一种氨基糖苷类抗生素 ,它的结构和新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞产生毒素 。当neo基因（新霉素抗性基因）被整合进真核细胞DNA后 , 获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶,使细胞获得抗性而能在含有418的选择性培养基中生长。,第五节 利用重
27、组DNA技术可对 基因进行改造,基因定点诱变 指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程,称为基因定点诱变. 1、 通过基因定点诱变可以改变蛋白质编码序列的个别密码子，可以改造蛋白质的结构与功能； 2、 通过改变具有调控功能的序列，可以确定DNA特定的功能区域； 3、 构建新的载体或嵌合基因。,一、带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变,二、Kunkel法,三、PCR技术适合进行基因的定点诱变,5,5,3,3,5,5,3,3,a,b,c,d,5,3,3,5,变性、退火,5,5,3,3,加klenow DNA聚合酶,5,3,5,3,加入引物a、d,5,3,5,3,3,5,3,利用基因定点诱变
28、可改变基因工程蛋白的特性,自然界的蛋白质常具有一定的可塑性，当某种蛋白质中的一些氨基酸被改变或删除后，其理化性质发生了改变，但仍能保存其原有生物活性同时一些蛋白质相互融合后仍保持各自成分的活性因此，通过基因突变而引起蛋白质结构与功能的改变是可行的,、定点诱变可制备长效胰岛素,将人胰岛素链位的改为，将链羧基端氨基化和链位改为后，其胰岛素的等电点从移至，在生理条件下结晶，从而延迟吸收其在血浆中的半衰期可延长至小时,、定点诱变可制备快速吸收的胰岛素,胰岛素在治疗糖尿病时，吸收非常慢，在注射后1。5至2小时，体内胰岛素还未达到高峰，而且在3-5小时后，其水平仍继续上升。 决定胰岛素在注射部位吸收速度决
29、定于胰岛素结合状态。胰岛素在体内吸收是以单体形式吸收的。而普通的胰岛素在中性情况下多数是与锌结合成六聚体，单体形式非常少。 研究发现多聚体之间形成与其B链的B8、9、12、13、16、23-28位残基有关，因此通过基因突变改变上述位置的氨基酸残基，可减少多聚体形成，提高吸收率。,3、通过基因诱变能增加胰岛素与受体的亲和力,通过对胰岛素结构模型分析，发现胰岛素与受体的结合是有特定空间结构的，因此通过基因诱变，改变一些氨基酸残基的组成，会增加其与受体的亲和力。,第六节 克隆基因在适当宿主细胞内表达,一、在大肠杆菌表达系统,（一）、在大肠杆菌系统表达外源基因需要一些基本要素1、来自真核细胞目的基因需
30、要改造2、必须选择用大肠杆菌载体3、注意目的基因连接在起始密码子之后：表达产物有融合蛋白和非融合蛋白两种（Nde：CATATG；Nco：CCATGG）4、选择适当的受体菌株和诱导条件,1、融合蛋白较稳定；2、如果载体携带的一段编码信号肽的基因片段，可产生分泌型产物；、可利用融合蛋白中原核蛋白制备的单抗进行亲和层析，便于纯化；、可利用融合蛋白中原核部分与表达蛋白之间加入的蛋白酶切位点，可切除原核部分。,表达融合蛋白优点：,（二）、提高外源基因表达水平1、提高外源基因表达水平：启动子结构；调整SD序列与ATG之间距离；用点突变的方法改变某些碱基；增加mRNA的稳定性2、将细菌生长与外源基因的表达在
31、时间上分开：减轻细胞的代谢负荷 3、采用不同措施提高表达蛋白的稳定性：表达融合蛋白；采用某种突变菌株；表达分泌蛋白；,二、真核表达系统,利用真核细胞作宿主表达系统的优点是： 真核细胞能够识别和除去外源基因中的内含子，剪接加工形成成熟的mRNA。 真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆菌表达的蛋白是没有糖基化的，糖基化对某些表达蛋白的免疫原性影响很大。,真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问题： 选择标记及选择系统只有少数几个； 转化效率低，一般只有10-610-4； 外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一定的自发性和盲目性，整合的拷贝数和位置都还不能控制； 细胞培养及细胞的挑选要求比较高，手续繁琐费时。此外，细胞大量培养还有不少问题，而且成本较高，利用培养细胞方式大量生产某些表达蛋白，从工艺到成本都要很好地考虑。,