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1、课题课题1 1 菊花的组织培养菊花的组织培养 组织培养组织培养是指在是指在人工培养基人工培养基上，上，离体培养离体培养植物的器官、组织、细胞植物的器官、组织、细胞和原生质体，并使其生长、增殖、和原生质体，并使其生长、增殖、分化以及再生分化以及再生植株植株的技术。的技术。 教学目标教学目标:1、说明植物组织培养的原理。、说明植物组织培养的原理。2、学习植物组织培养的基本技术，进、学习植物组织培养的基本技术，进行菊花或其他植物的组织培养。行菊花或其他植物的组织培养。教学重难点教学重难点:植物组织培养过程中使用的无菌技术。植物组织培养过程中使用的无菌技术。高度特化的高度特化的动物动物细胞，从整个细胞
2、来说，细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持细胞核仍然保持着全能性。着全能性。已分化的已分化的植物植物细胞，仍具有全能性。细胞，仍具有全能性。脱离母体脱离母体一定的营养物质、激素和其他一定的营养物质、激素和其他外界条件外界条件细胞的全能性细胞的全能性A.A.外植体：外植体：从从活植物体活植物体上切下进行培养的那上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官部分细胞、组织或器官. .B.B.脱分化：脱分化：由由高度分化高度分化的植物器官、组织或细的植物器官、组织或细胞产生胞产生愈伤组织愈伤组织的过程，又称去分化。的过程，又称去分化。C.C.再分化：再分化：脱分化
3、产生的愈伤组织在培养过程中脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化重新分化根或芽根或芽等器官的过程。等器官的过程。D.D.愈伤组织愈伤组织: :细胞排列疏松而无规则细胞排列疏松而无规则, ,是是高度液高度液泡化泡化的、呈无定形状态的的、呈无定形状态的薄壁细胞薄壁细胞。 同一植物材料的同一植物材料的年龄年龄、保存、保存时间时间的长短的长短都会影响实验结果。都会影响实验结果。 菊花的组织培养一般选择菊花的组织培养一般选择未开未开花植株的茎上部新萌生的侧枝花植株的茎上部新萌生的侧枝（2 2）离体的植物组织和细胞对营养、环境等）离体的植物组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基。
4、条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基。MSMS培养基主要成分包括：培养基主要成分包括：A A、大量元素大量元素: N: N、P P、 S S 、 K K、CaCa、MgMg等等B B、微量元素微量元素:B:B、MnMn、CuCu、ZnZn、FeFe、MoMo、I I、 CoCo等等C C、有机物有机物、植物激素植物激素MS固体培养基成分及比例固体培养基成分及比例你能说出各种营养物质的作用吗？同专题你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2 2中微生物培养基的配方相比，中微生物培养基的配方相比，MSMS培养基的配方培养基的配方有哪些明显的不同？有哪些明显的不同？ 微量元素和大量元素提供微量元素和大
5、量元素提供所必需的无机盐；所必需的无机盐；蔗糖蔗糖提供碳源，同时维持培养基的渗透压；提供碳源，同时维持培养基的渗透压；甘氨酸、维生甘氨酸、维生素素等主要是为了满足离体植物细胞的特殊营养需求。等主要是为了满足离体植物细胞的特殊营养需求。 微生物培养基微生物培养基以以有机营养有机营养为主。为主。MSMS培养基培养基则需提则需提供供大量无机营养大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。大量元素和微量元素两大类。常用的植物激素：常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素类：生长素类： 2 2，4 4二氯苯氧乙酸
6、（二氯苯氧乙酸（2 2，4 4D D）、吲哚）、吲哚乙酸（乙酸（IAAIAA）、萘乙酸（）、萘乙酸（NAANAA）、吲哚丁）、吲哚丁酸（酸（IBAIBA）细胞分裂素类：细胞分裂素类： 激动素（激动素（KTKT）、）、6 6苄基嘌呤（苄基嘌呤（ 6 6BABA）、玉米素（）、玉米素（ZTZT）赤霉素类：赤霉素类： 赤霉酸（赤霉酸（GA3GA3）生长素和细胞分裂素作用生长素和细胞分裂素作用 生长素和细胞分裂素是生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和启动细胞分裂、脱分化和再分化再分化的关键性激素。生长素存在的情况下，细胞分的关键性激素。生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。裂素的作
7、用呈现加强的趋势。使用顺序使用顺序实验结果实验结果先使用生长素，后使用细先使用生长素，后使用细胞分裂素胞分裂素利于细胞分裂，不利分化利于细胞分裂，不利分化先使用细胞分裂素后使用先使用细胞分裂素后使用生长素生长素细胞既分裂也分化细胞既分裂也分化同时使用同时使用分化频率高分化频率高生长素生长素细胞分裂素：细胞分裂素： 有利于有利于根根的分化，抑制芽的形成。的分化，抑制芽的形成。生长素生长素细胞分裂素：细胞分裂素： 生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素 生长素生长素再分化再分化植物细胞培养植物细胞培养需要光需要光植物组织培养的过程植物组织培养的过程离体的植物组织或细胞愈伤组织根和芽完整的植物体脱分化再分
8、化(1)(1)、培育无病毒植株培育无病毒植株(2)(2)、培养紫草愈伤组织培养紫草愈伤组织, ,提取紫草素提取紫草素（治疗烫伤和（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）割伤的药物以及染料和化妆品的原料）(4)(4)、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法(3)(3)、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子制成人工种子，可，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题。率低等问题。 同常规的无
9、性繁殖方法相比，组织培养主要具有以下优点：（1 1）快速。）快速。（2 2）周年生产。）周年生产。（3 3）经济效益高。）经济效益高。花卉组织培养快速繁殖所需要的空间小，在一个200平方米的培养室内一年可生产试管苗上百万株。如按每株1元计算，每年产值上百万元。（4 4）繁殖的种苗与母株有著相同的遗传基因。）繁殖的种苗与母株有著相同的遗传基因。组织培养与常规繁殖相比优点众多组织培养与常规繁殖相比优点众多 MSMS培养基包括培养基包括2020多种营养成分，实验多种营养成分，实验室一般使用室一般使用4 4。C C保存配制好的培养基母液来保存配制好的培养基母液来制备。制备。无机物中大量元素浓缩无机物中
10、大量元素浓缩1010倍，微量元素倍，微量元素浓缩浓缩100100倍，常温保存。倍，常温保存。激素类、维生素类以及用量较小的有机激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按物一般可按1mg/ml1mg/ml的质量浓度单独配制成的质量浓度单独配制成母液。母液。1 1、配置各种母液、配置各种母液2 2、配置培养基、配置培养基 配制培养液配制培养液 调调PHPH培养基的分装培养基的分装 分装好的培养基连同其他器械一起进行分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌。1 1、选材选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。2 2、消毒消毒流水冲洗流水冲洗 菊花茎段用流水冲
11、洗后可少许洗衣粉，用软刷菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min20min左右。左右。 酒精处理酒精处理 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为分数为7070的酒精中摇动的酒精中摇动2 23 3次次，持续，持续6 67s7s，立即，立即将外植体取出，在无菌水中清洗将外植体取出，在无菌水中清洗. . 消毒液处理消毒液处理 取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为入质量分数为0.10.1的的氯化汞氯化汞溶液中溶液中1 12mi
12、n2min，取出后，取出后在无菌水中至少清洗在无菌水中至少清洗3 3次，漂净次，漂净消毒液消毒液. . 用用7070的酒精喷雾的酒精喷雾使空气消毒，使空气消毒， 酒精或新洁酒精或新洁尔灭尔灭搽洗工作台并用搽洗工作台并用紫外线紫外线照射照射2020分钟。分钟。1 1、接种室消毒、接种室消毒 操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。每接种一块外植体前，镊子需消毒一次，每接种一块外植体前，镊子需消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种。然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却
13、后再接种。外植体在培养基中要分布均匀外植体在培养基中要分布均匀，一般胡萝，一般胡萝卜卜3 34 4块，菊的茎或叶块，菊的茎或叶6 68 8块，也不要太少，块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件。以充分利用培养基中的营养成分和光照条件。插入时应注意方向，插入时应注意方向，不要倒插不要倒插。茎段、茎茎段、茎尖基部尖基部插入培养基利于吸收水分和养分。插入培养基利于吸收水分和养分。思考：你打算做几组重复？你打算设置对照思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？实验吗？ 每种材料或配方每种材料或配方至少要做一组以上的重复至少要做一组以上的重复。设。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装
14、有培养基的置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。明培养基制作合格，没有被杂菌污染。1 1、愈伤组织的培养、愈伤组织的培养 从接种外植体到出现愈伤组织需经过从接种外植体到出现愈伤组织需经过2 2周周时间。时间。首次培养愈伤组织时，恒温箱首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。下愈伤组织长的更快。2 2周后，培养基成周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代分接近耗尽，必须更换培养基，进
15、行继代培养。培养。 继代培养所用培养基与培养愈伤组织的相同，继代培养所用培养基与培养愈伤组织的相同，继代培养一代为继代培养一代为20d20d。如果延长时间，外植体会分。如果延长时间，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为径为1 11.5cm1.5cm时，就可以进行时，就可以进行试管苗试管苗培养，否则还培养，否则还需进行第二代继代培养。需进行第二代继代培养。2 2、愈伤组织的继代培养、愈伤组织的继代培养 在继代培养期间，将恒温箱的门打开，愈伤组在继代培养期间，将恒温箱的门打开，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色。织见光后颜色可以转为绿色
16、。3 3、试管苗的培养、试管苗的培养 当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的基，进行试管苗的见光培养。见光培养。 移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。1 1、打开封口膜、打开封口膜2 2、清洗转移、清洗转移 用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间。生活一段时间。3 3、移栽、移栽幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗长壮后，移栽到土壤中
17、. . 幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。况，适时浇水、施肥，直至开花。基础知识基础知识实验操作实验操作植物体的植物体的组织培养组织培养影响组织培影响组织培养的因素养的因素细胞分化细胞分化细胞全能性细胞全能性组织培养过程组织培养过程营养营养激素激素环境条件环境条件MS固体培养基制备固体培养基制备外植体消毒外植体消毒接种接种培养培养移栽移栽栽培栽培课堂练习1.1.植物组织培养技术的理论基础之植物组织培养技术的理论基础之 一是（一是（ ）A.植物细胞的完整性B.植物细胞的多样性 C.植物细胞的全能性D.植物细胞杂交2.2.关于
18、愈伤组织的说法中不正确的是关于愈伤组织的说法中不正确的是A.愈伤组织的细胞能够进行细胞分裂B.用于培养形成的愈伤组织细胞能够进行光 合作用C.培养愈伤组织的培养基中含有有机养料D.人们可以从愈伤组织中提取所需物质3. 植物组织培养过程中的脱分化指植物组织培养过程中的脱分化指 A.植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞 B.未成熟的种子经过处理培育出幼苗的过程 C.植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产 生愈伤组织的过程 D.取植物的枝芽培育成一株新植物的过程4.4.植物组织培养是指植物组织培养是指A离体的植物器官或细胞培育成愈伤组织B愈伤组织培育成植株C离体的植物器官、组织或细胞培养成完 整植物体D愈伤组织形成高度液泡化组织