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1、( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因教学目标教学目标教学重点教学重点教学难点教学难点1. 理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理2. 了解缓冲液的组成及其作用了解缓冲液的组成及其作用 3. 血红蛋白的分离样品处理血红蛋白的分离样品处理凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理电泳法分离大分子的原理电泳法分离大分子的原理一、一、基础知识基础知识蛋白质提取和分离原理蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物化理性质：蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、形状、大小、电荷性质
2、和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。亲和力等千差万别。 提取提取分离分离方法方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （1）原理：）原理：（2 2）材料）材料大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （3）分离过程分离过程 混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢
3、收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。 分离蛋白质分离蛋白质由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等等1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （4）缓冲溶液洗脱剂缓冲溶液洗脱剂组成：组成：配制：配制：作用：作用：调节酸和盐的用量，可配制不同调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持的干扰而保持 pH稳定。稳定。2凝胶电泳
4、法：凝胶电泳法：（1）原理：）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素在一定在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的加入带负电荷多的SDS，形成，形成“蛋白质蛋白质SDS复合复合物物”，使蛋白质迁移速率，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。仅取决于分子大小。
5、2凝胶电泳法：凝胶电泳法：（2）分离方法：）分离方法：（3）分离过程：）分离过程： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。二、实验操作实验步骤二、实验操作实验步骤样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定 血液组成成分血液组成成分 1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.释放释放血红蛋白血红蛋白 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 4.透析透析血红蛋白血红蛋白血液组成成分血液组成成分阅读思考：阅读思考：1. 血液由血液由_和和_两部分组成。两部分组成。2. 血细胞中血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是最高的化合物
6、是_。3. 该化合物是由该化合物是由 _和和_构构成的，其中每个亚基中都含有一个能与成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和和CO2结合的结合的_基团。基团。血浆血浆血细胞血细胞红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白2条条-肽链肽链2条条-肽链肽链 亚铁血红素亚铁血红素1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞阅读思考：阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的目的是什么？洗涤过程：洗涤过程：血液血液100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色2.释放
7、释放血红蛋白血红蛋白阅读思考：阅读思考：1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？哪些物质？2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：1. 蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。2. 加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。3. 充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂3.分离分离血红蛋白血红蛋白分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心管离心管滤纸滤纸过滤过滤脂
8、类物质脂类物质烧杯烧杯4.透析透析血红蛋白血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mL1mL采集得到鸡血柜式离心机初次离心后的结果3次洗涤后的结果利用透析袋透析 加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加，再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于，置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟（分钟（加速细胞破裂加速细胞破裂）, ,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。将搅拌好混合液转移到离将搅拌好混合液转移到离心管内，以心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 10 minmin。第第1 1层（最上层（最上层）：甲苯层（层）：甲苯层
9、（无色透明无色透明）；第）；第2 2层层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色白色薄层固体薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：血红层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（蛋白的水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（层（最下层）：杂质沉淀层（暗红暗红色色）。）。用滤纸过滤，除去脂溶用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的分出下层的红色透明液体红色透明液体。磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作粗分离粗分离凝胶色谱操作凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱
10、的装填：凝胶色谱柱的装填：教材图教材图5193.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱材料：材料：交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液装填装填:2.凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填：步骤步骤操作要求操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量
11、凝胶固定色谱柱固定色谱柱3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆覆盖尼龙网，再用盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的目尼龙纱包好，插到玻璃管的一一端端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打
12、孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：。组装：将上将上述三者按相应位置组装成一个整体述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。注意事项注意事项1. 红细胞的洗涤：红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2. 凝胶的预处理：凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3. 色谱柱的装填：色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4. 色谱柱成功标志：色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。红色区带均匀一致地移动。为什么？为什么？装配好的凝胶柱知识总结知识总结血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法原原 理理分离过程分离过程凝胶电泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决定决定运动方向运动方向形成形成库仑力库仑力形成形成阻力阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小