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1、课时课时1 1血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链共四条肽链共四条肽链90血红蛋白血红蛋白与红细胞与红细胞1 1、血红蛋白血红蛋白与红细胞关系与红细胞关系血红蛋白血红蛋白与红细胞与红细胞1 1、血红蛋白血红蛋白与红细胞关系与红细胞关系2 2、血红蛋白、血红蛋白每个肽链环绕（每个肽链环绕（），此基），此基团可携带（团可携带（）。血）。血红蛋白因含有（红蛋白因含有（）而呈红色）而呈红色。本本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎
2、动物的血课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。液来分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳血红素血红素思思考考、人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人(猪、猪、牛、羊）的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？牛、羊）的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于，便于进行进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。红蛋白。思思考、考、分离生物大分子的基本
3、思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思思考、蛋考、蛋白质的分离和提取的原理是什么？白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思思考、高考、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质
4、的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构 本课题学习目标本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1 1 1 1、主要概念：、主要概念：、主要概念：、主要概念：凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2 2 2 2、主要原理：、主要原理：、主要原理：、主要原理：凝胶色谱法
5、分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理3 3、课题重点：、课题重点：、课题重点：、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法4 4、课题难点：、课题难点：、课题难点：、课题难点：样品的处理样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。一、基础知识：一、基础知识：（一）凝胶色谱法（分配色谱法（一）凝胶色谱法（分配色谱法）：）：（学生自主学习，再共同探究）（学生自主学习，再共同探究）1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多
6、贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（程（），移动速度（），移动速度（），而），而（）的蛋白质无法进入）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（凝胶内部的通道，只能
7、在（）移）移动，路程（动，路程（），移动速度（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。分离。4、具体过程、具体过程相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快分子量分子量大大小小直径大小直径大小大于大于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面小于小于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部运动方式运动方式垂直向下移动垂直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部运动速度运动速度较
8、快较快较慢较慢运动路径运动路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从先从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来后从后从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来 1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。(二二)缓冲溶液：缓冲溶液：2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）对溶液的）对溶液的（）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值 3、缓冲溶液的配制、
9、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就可以制得（）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3（三）电泳：（三）电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生、概念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。迁移的过程。思考：在血红蛋白的提取和分离实验中用思考：在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？的缓冲液是什么？它的目的是什么？使
10、用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）和材料的科学研究（活性）2、原理：许多重要的生物大分子，如（、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有）等都具有()在在()下，这些基团会带上（下，这些基团会带上（）。在）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）以及分子本身（）、（）、
11、（）的）的不同使带电分子产生不同的（不同使带电分子产生不同的（），），从而实现样品中各种分子的分离。从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH聚丙稀酰胺凝胶：聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交是由单体丙烯酰胺和交联剂联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶聚合交联成三维网状结构的凝胶分类：分类：琼脂
12、糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（测定（）通）通常用十二烷基硫酸钠（常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量二二、实、实验操作验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理血血液液血浆血浆血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定90水分水分固体物质固体物质（血（血浆蛋浆蛋白）白）目的：去除（目的：去除（）方法：方法：（）离心（速度越离心（速度越高和时间越长会
13、使白细胞和淋巴细胞等一高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（吸管吸出上层透明的（），将下），将下层（层（）的红细胞液体倒入（）的红细胞液体倒入（）(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤杂质蛋白杂质蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯1.样品处理样品处理红红细胞的洗细胞的洗涤涤-血血红蛋白的释红蛋白的释放放-分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液再加入再加入用（用（）的（）的（）即质量分数为即质量分数为 0.9的氯化钠的氯化钠溶液洗涤溶液洗涤 低速离心（低速短时间）低速离心（低速短时间）重复上述步
14、骤（重复上述步骤（）次，直至上清液）次，直至上清液中已没有（中已没有（），表明洗涤干净。），表明洗涤干净。利利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。次数过少。五倍体积五倍体积生理盐水生理盐水三三黄色黄色（2）血红蛋白的释放）血红蛋白的释放 加（加（）到（）到（）体积，）体积，再加再加40体积的（体积的（）（）（溶解细胞膜溶解细胞膜），置于（，置于（）上充分搅拌）上充分搅拌10分钟分钟（加速细胞破裂）（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋细胞破裂释放出血红蛋白白.(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转：将搅拌好混合液转移到离心管内，以移到
15、离心管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10 min，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水目的：目的：使红细胞破裂，血红蛋白释放使红细胞破裂，血红蛋白释放第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层 （）的液体）的液体 第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色用滤
16、纸过滤，用滤纸过滤，除去脂溶性沉除去脂溶性沉淀层，于分液淀层，于分液漏斗中静置片漏斗中静置片刻后，刻后，分出下分出下层的红色透明层的红色透明液体液体。原理：课本图解，思考？原理：课本图解，思考？取取()ml的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量的物质的量浓度为浓度为20mmol/L的（的（）中，）中，pH为（为（），透析），透析12小时，目的是（小时，目的是（）或用于更换样品中的（）或用于更换样品中的（）。透）。透析袋一般用析袋一般用硝酸纤维素硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液2 粗提取粗提取透析透析1目的：目的：a.除去样品中相对分子质量较小的除去样品中相对分子质量较小的杂质杂质 b用于更换样品的缓冲液用于更换样品的缓冲液二二、实、实验操作验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定课后练习课后练习