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1、番茄基因克隆与植物表达载体的构建【目的】克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.【方法】以“耐运番茄幼苗为试材,根据GenBna中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBIPDHi;利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA中.【结果】所克隆到的ProDH基因片段长bp,其中CDS为bp,编码个氨基酸.测序结果与公布序列同源性,因而能够用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定
2、,证实表达载体构建成功.【结论】经特异性引物扩增检测,证实表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.关键词:番茄;ProDH;RNA干扰;载体构建番茄为茄科番茄属的一年生草本植物.番茄原产于南美洲地区,已发展成为广泛分布于世界不同地区的重要蔬菜作物.植物在逆境胁迫下的生理反响称为逆境生理.对于抗寒性强的番茄品种,温度低于时生长发育受阻,时表现寒害症状,生长完全停止.探索植物抗寒性的生理机制及其遗传因素,在解决生产实际问题上具有广泛的应用价值.植物抗寒基因工程研究包括导入调控功能基因和导入抗寒调控基因.植物体内脯氨酸含量在干旱、低温、高盐等浸透胁迫下会增加.逆境胁迫下植物体内的脯氨酸
3、降解遭到抑制.脯氨酸的积累能有效降低细胞质水势,维持细胞内水分平衡,进而起到保护的作用.植物体内脯氨酸的含量在一定程度上能够反映植物对环境胁迫耐受能力的强弱.编码运输脯氨酸蛋白(ProT)的基因已经从拟南芥、水稻、番茄、大麦等作物中克隆得到.编码脯氨酸合成酶基因的研究较为深化,而在植物中对番茄脯氨酸脱氢酶基因的研究较少,主要在拟南芥、青花菜、甘蓝等植物中,对青花菜的ProDH基因的RNA沉默,能够有效的提高其对干旱胁迫和盐胁迫的抗性.RNA干扰(RNAinterference,RNAi)能够高效地抑制特定基因的表达,利用该技术能够有效地使目的基因沉默,所以作为分析特定基因未知功能的RNAi技术
4、已广泛应用于植物基因工程的研究中.本试验旨在对番茄ProDH基因进行克隆与RNAi载体的构建,为开展ProDH基因的表达抑制、功能等研究打下基础,通过基因沉默提高番茄的耐寒性.材料与方法材料材料为番茄号保存品种、中间载体HMWInt和表达载体pBI、根癌农杆菌菌株EHA由北京农学院蔬菜遗传育种与生物技术实验室.pMDT克隆载体试剂盒为TaKaRa公司产品;大肠杆菌感受态DH购自北京天根公司.EASYspin植物RNA快速提取试剂盒、RNA清洁纯化试剂盒、高纯度质粒小量快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒均为北京Aidlab公司产品;LATaqDNA聚合酶、TDNA连接酶及各种限制性内切酶均
5、为TaKaRa公司产品;利福平(Rifampicin,Rif)、卡那霉素(Kanamycin,Km)、氨苄青霉素(Ampicillinum,Amp)、XGal、IPTG为Sigma公司产品.引物合成及测序由上海生工生物技术有限公司(北京部)完成.试验方法番茄ProDH基因的克隆根据EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab公司)讲明书提取番茄叶片的总RNA,并用DNA酶消化处理,纯化回收.测A/值,并用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量,保存.用MMLV反转录酶(TaKaRa公司)对总RNA进行反转录,获得cDNA,保存备用.参照ProDH基因(GenBan登录号为BT)的序列设计特异
6、性引物.上游引物为:AAATTTCATCTTCCGCCG,下游引物为:TAGTCGGCGATGTTTCCTC,由上海生工生物技术有限公司北京合成部合成.以cDNA为模板进行PCR扩增,以无菌水为模板做阴性对照.扩增产物在的琼脂糖凝胶上电泳检测并回收.将目的片段与T载体(pMDT)连接.将连接产物参加DH感受态细胞中,菌液涂布并挑取平板上的白色单克隆,做菌落PCR阳性鉴定.将检测正确的阳性克隆送去上海生工生物有技术限公司进行测序,由于片段较长,进行双向测序,拼接.将测序结果与GenBna中注册的番茄ProDH基因进行同源性比拟.番茄ProDH基因RNAi表达载体的构建利用DNAman软件分析番茄
7、ProDH基因的DNA序列,根据中间载体、表达载体和基因序列上的酶切位点,在开放阅读框中选择了bp的CDS序列作为干扰目的片段,用PrimerPimerr软件设计含有酶切位点的引物.为使反向重复序列能够插入表达载体PBI的多克隆位点,分别在正反向引物中参加SacIBamHI、和SmaIB、glII酶切位点和相应的保护碱基.扩增反义片段引物为:CGAGCTCAACTCTCCAATTCACGACAG(含SacI酶切位点),GGATCCTCAGCCCAAATGAAAGCCCA(含BamHI酶切位点);扩增正义片段引物为:CCCCGGGAACTCTCCAATTCACGACAG(含SmaI酶切位点),G
8、AGATCTTCAGCCCAAATGAAAGCCCA(含BglII酶切位点).以cDNA为模板,使用LATaqDNA聚合酶分别扩增正反义片段,以无菌水为模板做阴性对照.将PCR扩增产物电泳检测后回收目的片段,分别和pMDT克隆载体连接,转化大肠杆菌DH感受态细胞.挑取单克隆,做菌落PCR鉴定.鉴定为阳性的菌液送去上海生工进行测序,将测序结果在NCBI上通过BLAST进行同源性比对.将鉴定为阳性的菌液用高纯度质粒小量快速提取试剂盒提取正反义质粒,分别命名为Ps和Pa.所得到的质粒溶液用于后续试验或置于保存备用.用SacI和BamHI分别双酶切反义质粒Pa和载体质粒HMWInt,用TDNA连接酶将
9、正义片段与中间片段连接,将连接产物转化大肠杆菌DH感受态细胞,用含有mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜挑选重组子.挑取单克隆,用反义片段引物做菌落PCR扩增鉴定;用质粒回收试剂盒提取质粒DNA,用于酶切鉴定;将阳性单克隆的菌液送去公司做测序鉴定.将鉴定正确的质粒命名为HMWIntPa.用SmaI和BglII分别双酶切质粒HMWIntPa和正义质粒Ps,用TDNA连接酶连接正义片段和连有反义片段的中间载体并将连接产物转化大肠杆菌DH感受态细胞,用含有mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜挑选重组子.挑取阳性单克隆用质粒回收试剂盒提取重组子质粒DNA,用于酶切鉴定.RNA干扰表达载体转
10、化根癌农杆菌将保存的农杆菌菌液解冻活化,取L载体质粒参加到L冰上融化的农杆菌感受态细胞中,用枪轻轻混匀,冰浴min;挑取农杆菌单菌落于mLYEB液体培养基(含mg/LRif,mg/LKm)中,振荡培养过夜.用特异性引物PDHiaF和GRR进行PCR扩增验证转化子.结果与分析番茄叶片的总RNA用核酸蛋白检测仪检测总RNA的浓度为mg/L,OD/为.图为番茄叶片总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测图.ProDH基因的克隆以第一链cDNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,根据引物在ProDH基因上的位点,推断扩增产物大小应该在bp左右.PCR扩增产物经的琼脂糖凝胶电泳检测,从图中能够看出,其扩增片段大约为
11、bp,与预期大小一样.纯化回收目的片段后与pMDT克隆载体连接,转化大肠杆菌感受态DH,蓝白斑挑选阳性单克隆菌落摇菌,以菌液为模板进行PCR扩增,扩增产物经电泳检测,扩增片段约为kb,与预期大小一样,初步证实目的基因插入了pMDT载体.将检测正确的阳性菌液送去测序,测序结果表明,PCR扩增产物长bp,含有扩增时所用的引物序列.对克隆得到的核苷酸序列进行同源性分析,通过Blast比对,与GenBna中ProDH基因序列(登录号为BT)同源性为.因而,能够以此基因序列为基础,构建番茄ProDH基因RNA干扰植物表达载体,进一步研究该基因的功能,为获得抗寒性强的番茄植株奠定基础.ProDH基因RNA
12、i植物表达载体的构建中间载体的酶切鉴定对构建好的中间载体质粒进行双酶切鉴定,用内切酶SacI和BamHI进行双酶切,估计切出约bp的反向片段;用内切酶SmaI和BglII进行双酶切,估计切出约bp的正向片段;用内切酶SacI和SmaI进行双酶切,估计切出包含正向片段、反向片段和内含子的约bp的片段.酶切鉴定结果如图,分别切出了大约bp、bp和bp的目的片段,讲明中间载体已经构建成功,正向片段和反向片段分别插入到了内含子的两侧,中间载体构建成功.干扰载体鉴定挑取阳性单克隆进行PCR扩增检测,检测用正义片段上游引物和内含子下游引物,估计扩增出大约bp的目的片段,菌液进行双向测序,序列比对结果如图和
13、,干扰载体的主体部分和番茄ProDH基因序列同源性很高,并且正向片段两端的酶切位点SacIBamH、I和反向片段两端的酶切位点SmaIB、glII完好,讲明番茄ProDH基因RNA干扰表达载体构建成功。3干扰载体转化农杆菌的菌液PCR鉴定提取PBIPDHi表达载体质粒DNA,转化农杆菌EHA感受态细胞,挑选转化子.挑取单菌落摇菌后,以菌液为模板进行CR扩增,检测用特异性引物PDHiaF和GRR,扩增出大约bp的目的片段(标出泳道序号),证实干扰表达载体已经成功转入农杆菌中(如图).以番茄cDNA为模版,对ProDH基因的克隆,用特异性引物进行PCR扩增,回收目的片段后与pMDT克隆载体连接,转
14、化大肠杆菌感受态DH,蓝白斑挑选阳性单克隆菌落摇菌,成功扩增到番茄ProDH基因长约kb的片段,编码个氨基酸,将检测正确的阳性菌液送去测序,测序结果表明,PCR扩增产物长bp,含有扩增时所用的引物序列.对克隆得到的核苷酸序列进行同源性分析,与GenBna中ProDH基因序列(登录号为BT)同源性为.连接T载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH.挑取单克隆,做菌落PCR鉴定和测序检测.对构建好的中间载体质粒进行双酶切鉴定,分别切出了大约bp、bp和bp的目的片段,讲明中间载体已经构建成功,正向片段和反向片段分别插入到了内含子的两侧,中间载体构建成功.挑取阳性单克隆摇菌进行PCR扩增检测,检测用正义片段
15、上游引物和内含子下游引物,估计扩增出大约bp的目的片段,构建好的干扰载体TDNA(如图)又插入到双元表达载体PBI的CaMVS启动子和NOSter终止子之间.将检测正确的干扰载体质粒命名为PBIPDHi.成功构建了番茄ProDH基因的RNAi植物表达载体PBIPDHi,表达载体是含有一段内含子的正反向重复序列.利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA中,经特异性引物扩增检测,证实表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因创造了条件.与脯氨酸相关的抗寒基因工程的研究报道主要集中在脯氨酸运输蛋白基因、脯氨酸合成反响限速酶基因和脯氨酸降解限速酶基因三个方面.利用基因工程手段进行脯氨酸代谢相关基因的植物遗传转化研究,以提高脯氨酸的积累,进而提高植物对严寒胁迫的耐受力.编码脯氨酸合成酶基因的研究较为深化,通过转基因技术转入脯氨酸合成酶相关基因,使植物产生更多的脯氨酸,鉴定其抗性的加强.