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1、香石竹查尔酮合酶基因的克隆与植物反义表达载体的构建|查尔酮合成酶 R943A16723783(2011)06000202 依据已发表的查尔酮合酶(CHS)基因的序列，设计一对引物，以香石竹品种 Master 的总cDNA为模板,扩增出香石竹查尔酮合酶基因全阅读框架序列，以Pgem-T为中间载体，序列检测的结果显示同Henkel,J.等在NCBI的基因库中发表的从香石竹品种“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全开放阅读框序列一样。将序列反义克隆到双元载体PBI-121上，并导入农杆菌中 ，经PCR及酶切分析鉴定，结果表明该片段的反义序列已克隆于载体中。 查尔酮合酶 植物反义表达载体 基
2、因克隆 花色的形成与植物体内一类次级代谢产物类黄酮有关。在花色形成中起最主要作用的是花色素。花色素在花瓣中含量的增高或降低都可能变更花的颜色1。查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是花色素合成中的一个关键酶,它催化丙二酰辅酶A的3个乙酸基和对羟基苯丙烯酰辅酶A的一个乙酸基的缩合,产生柚配基查尔酮2。 反义（Antisense RNA ）技术是通过人工导入反义,调控细胞内某些基因的表达,从而定向限制某些生物性状。该项技术在基因功能探讨、恶性生长限制、人工免疫及植物基本功能等方面的作用日渐显著。反义技术可以专一性地调整某一基因的活动,进一步了解这个基因的作用,这对探讨未知基因的
3、功能和表达状况供应了思路和途径,也为人类限制基因活动供应了方法。由于反义主要作用于转录水平,所以它可以避开二倍体生物同源基因互补而产生的困难。此外,反义对基因的调整不会变更目的基因的结构,在应用上更为平安。为此,近年来利用反义技术在花卉的品质改良上取得了很有价值的成果3。 在植物中，CHS组成了一个多基因家族，具有810个成员，位于两个不同染色体上4，并且其正常表达主要集中于花组织中（花冠和花药）5。在本探讨中，我们从特定发育阶段的香石竹花瓣中通过rt-PCR方法克隆到CHS基因的cDNA序列，并以此为模板构建了其反义基因的植物表达载体。 1材料和方法 1.1 材料：香石竹品种 由云南省农科院
4、花卉中心供应，大肠杆菌DH5a，农杆菌LBA4404，双元表达载体PBI-121为云南省生物技术重点试验室保存，克隆载体pGEM-T试剂盒，cDNA合成试剂盒购自Promega公司, 其余分子生物学试剂均购自华美生物工程公司. 2 方法 1.2.1 植物组织总RNA的提取：香石竹的花蕾长到3-5厘米即将开放时将其采下，置于-700冻.藏。临用时，取1-2个这样的花蕾用液氮研磨成粉末，依据购自Promega公司的Trizol总RNA提取试剂盒内说明书的指示步骤：加入1 ml Trizol猛烈振荡15 s，室温放置5 min。后加入200 l氯仿，猛烈振荡15 s，室温下放置3 min后于4，12
5、,000g，离心15 min。然后取上层水相，加入500 l异丙醇，室温下放置10 min。再于4下，12,000g，离心10 min。最终弃上清，沉淀用1 ml 70%的乙醇洗两次，在超净台上吹干，溶于适量DEPC处理过的灭菌水中，-20保存备用。 1.2.2cDNA第一链的合成：cDNA第一链的合成根据Promega公司cDNA合成试剂盒内的说明书进行。以香石竹的总RNA为模板，oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下,合成cDNA第一链，于-20保存备用。 1.2.3扩增CHS基因序列：依据 NCBI上发表的香石竹CHS基因的cDNA序列，设计一对引物，由上海博亚生物工程公司合
6、成，引物序列为：ACHS5- AAGAGCTCATGGCATCAATTGAGGA-3 ACHSAt5- GGTCTAGATCAACAATTCAATGGAAC-3以合成的cDNA为模扳进行PCR扩增，反应的条件为94变性40秒，50退火1分钟， 72延长2分钟，共35个循环。 1.2.4PCR扩增产物的克隆：对PCR扩增产物进行回收纯化,依据克隆载体pGEM-T试剂盒操作说明，在T4连接酶的作用下，将其连接于克隆载体pGEM-T上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，其后涂布于x-gal/IPTG培育基上过夜培育。 1.2.5克隆子的测序鉴定：挑取白色菌落进行培育，送由上海博亚生物工程公司进行测序。
7、 将测序后含有CHS基因的菌体抽提质粒保存。 1.2.6CHS基因植物反义表达载体的构建：PCR引物设计时在两端加上了Sac1和Xba1酶切位点，因此，将含有CHS基因的质粒抽提纯化好后进行Sac1和Xba1双酶切,将小片段回收后克隆到经过Sac1和Xba1双酶切的双元表达载体PBI121的大片段上,得到CHS基因植物反义表达载体。 2 结果 2.1 在植物正常发育过程中,只有CHSA和CHSJ被表达,并且这种表达限于花组织中(花冠和花药),其中由CHSA转录的mRNA占总CHSmRNA的90%。以逆转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到1.1kb左右的片段，将此片段回收纯化后，克隆于
8、pGEM-T载体上，挑取8个白色菌落经测序后，得到克隆序列有1173bp，与Henkel,J.等在NCBI的基因库中发表的从香石竹品种“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全开放阅读框序列一样。其序列如下(划线部分为两端引物)： 5-GGCATCAATTGAGGAGATTCGTCAGGCTCCAAGGGCCGATGGTCCTGCTACTATTTTGGCTATCGGTACTGCTACTCCGCCCAATGCTATCTATCAGGCAGATTATCCCGATTATTATTTTCGGGTTACTAAGAGTGAACATATGACTGAATTGAAGGAGAAATTTCGACGCATGTGCG
9、ATAAGTCGATGATCAAAAAGCGATACATGTACCTAACCGAGGAAATCCTCAAGGAGAACCCGAACTTGTGTGAGTACATGGGTTCATCTCTCGACACACGACAAGACATGGTCGTTTCGGAGGTCCCTAGGCTAGGCAAAGAAGCCGCGGTGAAGGCCATTAAGGAGTGGGGCCAACCTAAGTCCAAAATAACTCACGTTATCATGTGCACCACCTCCGGTGTCGACATGCCCGGGGCTGACTACCAGCTCACTAAGCTCCTTGGGTTGCGTCCCTCTGTCCGTCGCTTCATGCTCTACC
10、AACAGGGTTGCTTCGCCGGGGGAACGGTTCTAAGGCTTGCTAAGGACTTGGCTGAGAACAACAAGGATGCGCGTGTCCTTGTTGTCTGTTCTGAAATCACTGCTATTTGTTTTAGGGGCCCCACCGAGGCTGCTTTGGACTCCATGGTGGGCCAAGCCCTCTTTGGGGATGGTGCTGGAGCCTTGATTGTTGGGTCGGACCCCGACTTGTCGATTGAGAGACCCCTTTTTCAAATGGCTTGGGCCGGTCAAACCCTACTCCCTGACTCCGACGGGGCTATCGACGGACACTTGCGTGAGG
11、TGGGTCTCACTTTTCACCTGCTCAAGGACGTGCCGGGGATTATTTCGAAGAATATTACTAACGCCCTAGAGGATGCGTTCAGTCCTATCGGGGTAAGTGACTGGAACAATCTATTTTGGATCGCGCACCCTGGTGGGCCCGCAATCCTAGACCAAGTCGAGGCCAAATTGGGGCTAAAGGAAGAGAAGCTGGCAGCCACTAGGAATGTGTTGAGCGACTTTGGGAACATGTCGAGCGCGTGCGTGCTGTTCATTCTGGATGAAATGAGGAAGAAGTCGCTTAGAGACGGTGCGACCACAA
12、CAGGTGAAGGGCTCGATTGGGGTGTTCTGTTCGGGTTTGGGCCAAGTTTGACCGTCGAAACGGTCGTGCTCCACAGTGTTCCATTGAATTGTTG-3 2.2植物重组表达载体的构建和鉴定 将pGEM-T载体进行Sac1/Xba1双酶切后，回收1.1kb处小片段，克隆到经Sac1/Xba1双酶切的双元载体上，因为酶切方向，35S启动子干脆调控CHS基因序列的有义链，转录合成反义RNA序列。得到的阳性重组克隆经过PCR和酶切鉴定后确定为CHS基因反义表达载体。 探讨 香石竹是世界四大鲜切花之一，在花卉市场上占有重要的地位。花色是欣赏植物最重要的指标之一，欣
13、赏植物产业始终不断开发新产品,以适应市场的须要。这些改良后的新品种应有更高的欣赏价值和商品价值。改良的性状包括花的形态和花的颜色等。在花色改良的探讨中,蓝色花始终是探讨的重点。在众多欣赏植物中,蓝色花偏少,用作欣赏的切花香石竹、郁金香、月季、玫瑰等都缺乏蓝色花系6。到目前为止,大多数蓝色花的新品种都是采纳传统育种法而获得的,此法有许多局限性。蓝花植物的花色素主要是翠雀素。翠雀素是通过环3和5位置的羟化形成的,但多数缺乏蓝颜色的花都无在环3和5羟化的花色素苷。有人对670种玫瑰栽培品种进行分析,结果没有见到任何在环5位置羟化的花色素苷的存在，因此用传统的育种法来培育缺乏前体的蓝花是不行能的7。
14、导入植物内某内源基因的正义或反义基因以抑制该内源基因的活性，是目前采纳基因工程变更植物花色的主要方法之一。1990年,美国和荷兰的科学家发觉,当植物体内导入的结构基因不止一个拷贝时,转基因植物的内源基因常被抑制8。将克隆的花色素苷生物合成结构基因导入植物细胞内,可以导致同源的内源结构基因表达变更，Jorgensen作了具体的评述9。Nopoli10等和Van der Krol等分别将CHS或DFR导入矮牵牛植株导致同源的内源CHS和DFR基因表达受到抑制。Van der Krol等将结构基因的反义CHS基因导入矮牵牛，导致矮牵牛内源的CHS结构基因表达受到抑制，引起花色变异11。在反义CHS基
15、因启动子中加入28bp的花药盒（anther box），导入矮牵牛后，反义CHS基因表达量显著增加，剧烈抑制内源的CHS基因表达，导致类黄酮生物合成受到剧烈的抑制，最终引起矮牵牛的雄性不育12。 本探讨通过克隆香石竹中的花色关键酶CHS的基因序列，构建了其反义表达载体，旨在应用反义技术，对香石竹花色机理进行探研，以期获得花色变异的品系。目前，该载体转化香石竹的工作以及CHS基因反义序列原核表达载体的构建工作正在进行。 参考文献 1 StevensonTW.PlantGeneticEngineering.London:CRCPress,1990.1271482 2 MeerMI.Controlo
16、fPlantGeneExpression.London:CRCPress,1993.118 3 葛欣,赵宇,张建军等 花卉的品质改良与反义技术北方园艺总第31期，35 4KoesRE,SpeltCE,vanderElzenPJM.Cloningandmolecularcharacterizationofthechalconesynthasemultigenefamilyofpetuniahybrida.Gene,1989.81:245257 5 邵利、李毅、陈章良等 查尔酮合酶基因的克隆、全序列分析及在大肠杆菌中的高效表达 生物工程学报 11(2):145149 1995 6 黄胤怡沈明山李鹏等 蓝色花的基因工程 植物生理学通讯38(2):203206 2004 7 许智宏,刘春明.植物发育的分子机理.北京:科学出版社,1998.115116 8 黄胤怡沈明山李鹏等 蓝色花的基因工程 植物生理学通讯38(2):203206 2004 作者单位：678000 云南省保山市隆阳区保山中医药高等专科学校