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1、降植烷诱导小鼠类风湿关节炎模型（中国免疫学杂志）2015年第十一期类风湿关节炎(heumatoidarthritis，A)是一种以进行性、侵蚀性关节毁坏为特征性病理改变的全身性本身免疫病。其基本病理改变主要是滑膜慢性炎症及关节软骨和骨质的毁坏，临床特征为关节构造的炎症和肿胀、慢性进行性病程，并可致多个关节完全强直，最终导致功能的丧失，致残率高1。因而，为临床发病机制的研究及寻找新的诊疗手段，建立一种能准确模拟A发病经过的动物模型尤为重要。目前，最为常用的A模型为型胶原诱导的小鼠或大鼠模型，但其建模经过需要通过尾静脉注射型胶原和佐剂的混合物，操作难度大2。降植烷是一种常用的致炎剂，有文献报道其能
2、不依靠于T或B细胞激活免疫系统引起免疫反响3，4。本文以BALB/c小鼠为研究对象，拟制备降植烷诱导的A小鼠模型并对其免疫病理变化进行评价。1材料与方法1.1实验动物及分组68周雌性BALB/c小鼠30只，体质量2530g，由苏州大学实验动物中心提供。采用随机数字表法分为模型组及对照组，每组15只。SPF级动物房常规饲养。实验方案得到苏州大学附属第一医院动物伦理委员会批准。1.2主要试剂降植烷，即2，6，10，14-四甲基十五烷，购于美国Sigma公司。PE标记抗小鼠抗体CD11b、CD11c、Gr1，FITC标记CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)
3、，APC标记抗小鼠抗体B220均购置美国eBioscience公司。1.3降植烷诱导A小鼠模型的制备小鼠适应性饲养1周，造模组于0周、9周、18周时腹腔各注射0.5ml降植烷;对照组于一样时间腹腔注射0.5ml生理盐水。第21周时，采用颈椎脱臼法处死小鼠，保留小鼠脾脏及双侧后肢关节，分别行免疫学及组织病理学检测。1.4小鼠足趾厚度的测定从第18周起，使用游标卡尺对小鼠同侧的后足跗跖关节肉厚处进行测量，每周测量2次，每次重复测量3次，取平均值。所有测量由两名实验者独立完成。1.5关节炎指数评分(Arthritisindex，AI)从第18周起，对各组小鼠关节肿胀程度进行评分，每周评测2次，每次重
4、复测量3次，取平均值。采用关节炎评分法(04分)5，0分:无关节炎;1分:有红色斑点或轻度肿胀;2分:关节部位中度肿胀;3分:严重肿胀;4分:严重肿胀且不能负重，四肢评分的和即为关节炎指数(最大分数16)。1.6流式细胞检测脾细胞免疫分子表达变化取小鼠脾脏制成单细胞悬液，5105个细胞参加各流式分析管，分别参加PE标记抗小鼠抗体CD11b、CD11c、Gr1，FITC标记CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)，APC标记抗小鼠抗体B2204避光孵育1h，经洗涤，1%多聚甲醛固定，流式细胞仪分析细胞的免疫分子在脾脏细胞中的表达情况。1.7组织学观察小鼠处
5、死后切取后肢膝关节，剔除皮毛和肌肉浸泡于4%甲醛溶液固定3d，而后放入10%EDTA液中脱钙30d，常规石蜡包埋，4m切片，HE染色，普通光镜观察。1.8统计学处理所有实验数据以xs表示，SPSS16.0统计软件处理数据。采用t检验进行统计学分析，分析前所有数据均进行方差齐性检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1小鼠一般情况造模期间，小鼠无死亡。正常组小鼠精神状态好，能正常爬行，关节活动自若，无红肿;第三次注射免疫(18周)后，造模组有11只小鼠出现症状(成模率73.3%)，详细表现为足爪红肿，体型消瘦，毛色杂乱稀疏，步态异常，倦怠易激惹;足部存在不同程度肿胀，关节增粗，黏膜红肿渗出
6、。见图1。小鼠足掌厚度测量结果显示，21周时模型组小鼠后足肿胀最为明显，厚度为(2.900.51)mm，与对照组(1.290.47)mm比拟，差异有统计学意义(t=6.097;P0.05);关节炎评分结果显示21周时11只成模小鼠中，有4只症状较轻，7只发病严重，关节炎指数为9.552.80。2.2组织病理学观察正常小鼠膝关节构造完好无损，无骨小梁吸收，关节软骨光滑平整(图2A)。模型组小鼠膝关节构造被毁坏，有骨小梁吸收，关节软骨可见坏死脱落，纤维化，关节腔狭窄。炎细胞大量浸润，伴有程度不同的软组织水肿。2.3小鼠脾细胞流式细胞检测结果21周时取脾脏制成单细胞悬液，荧光抗体标记后经流式细胞仪检
7、测，结果显示，模型组脾脏细胞中CD11b、CD11c和G1表达明显增加，提示吞噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞亚群数量增加(表1，P0.05)。模型组中T细胞外表的外表标志CD4、CD8、CD154均有不同程度的增高，与对照组比拟差异有统计学意义(表2，P0.05)。模型组和对照组脾脏细胞中B220及CD21、CD23、CD80、CD86的表达未有明显差异(P0.05，结果未列出)。3讨论类风湿性关节炎是一种累及全身关节的本身免疫性疾病，其病理特征是慢性炎细胞浸润和滑膜增生，最终导致关节软骨和骨质毁坏1。迄今为止，A发生确实切机制尚不清楚，还没有有效的预防和治疗方法，所以，建立一种能够准确模拟人
8、类A发病经过的动物模型对研究A病因及药物治疗至关重要。降植烷，即2，6，10，14-四甲基十五烷，是叶绿素分解后的产物。有学者发现降植烷能促进小鼠B淋巴细胞瘤的发生，而将降植烷经腹腔注射后能诱导产生狼疮特异性抗体，实验小鼠表现出明显的系统性红斑狼疮的特征。在本研究中，笔者将0.5ml降植烷经腹腔注射给BALB/c小鼠，并在9周和18周时各补注1次，21周时实验小鼠表现出明显的关节炎症状，发病率为73.7%，与Potter等10报道一致。组织学染色发现，实验小鼠关节滑膜增生明显，有大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞和单核细胞为主，软骨和骨组织毁坏明显，有血管翳构成，与人类A患者病变关节组织病理改变类
9、似。汪婷婷等4在降植烷诱导的大鼠关节炎模型中也发现了类似的病理改变。上述结果提示经腹腔注射降植烷能够诱导小鼠产生关节炎病理改变。有研究表明，T细胞尤其是CD4+T细胞在A发病经过中起重要作用。在A滑膜浸润的单核细胞中，30%50%为T细胞，而且这些细胞多处于活化状态，并且通过与巨噬细胞互相作用，引起软骨和骨组织毁坏。笔者研究发现，降植烷免疫后的小鼠脾脏中CD4、CD8和CD154+T细胞数量明显增加，提示降植烷可能通过调节T细胞引起小鼠关节炎病理改变。Holmberg等的研究表明降植烷是一种非免疫原性的佐剂，不能被T细胞或B细胞特异性识别，降植烷致关节炎的能力也就取决于其对免疫系统的非特异性刺
10、激引起的本身反响性T淋巴细胞活化，引起关节急性炎症，随后进入慢性进展和反复发作阶段。因而，在免疫学特征方面，降植烷诱导的A模型可能更类似于A患者，更适于A病理机制的研究。B细胞在A关节滑膜中的数量较少，但近年来的研究发现B细胞在A发病机制中起重要作用。Takemura等证明A滑膜中T细胞的激活和作用是B细胞依靠性的;B细胞作为一种抗原递呈细胞，向T细胞提供共刺激信号;B细胞还能通过分泌TNF-等炎症因子、趋化因子以及类风湿因子等进一步加重A关节毁坏16，17。我们的结果显示在降植烷诱导小鼠狼疮性肾炎的起始阶段可引起B细胞功能活化，但是，在本研究中流式细胞检测结果表明，降植烷免疫后的小鼠脾脏内B细胞外表标志CD21、CD23、CD80、CD86的表达未有明显差异，我们揣测B细胞功能在降植烷引起的后期免疫反响趋于稳定。综上所述，经腹腔注射降植烷能够成功诱导小鼠关节炎，并产生与A患者类似的免疫学改变，是一种可靠的A动物模型，为讨论A的发病机制及寻找A的诊疗的新技术新方法提供研究工具和物质基础。