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1、辣椒碱纳米乳粒径测定1仪器与试药1.1仪器JB?2型恒温磁力搅拌器上海智光仪器仪表有限公司，十万分之一电子分析天平BP211D，德国赛多利斯，F?4500Hitachi荧光分光光度计日本日立公司，ZetasizerNanoZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪英国MalvernInstrumentsLtd，JEL?IOOCX透射电镜(日本)，ShimadzuLC?10A高效液相色谱仪日本岛津公司，ShimadzuRF?10AXL荧光检测器日本岛津公司。1.2试药辣椒碱原料贵州安顺生达生物科技开发公司，纯度97%，批号20030503，辣椒碱对照品SIGMA公司，纯度97，批号2069698，中链
2、脂肪酸三甘油酯MCT，德国SasolGermanyGmbH，iv级，批号061224，吐温80上海申宇医药有限公司，药用级，批号080201，豆磷脂上海金伴药业有限公司，药用级，批号021109，葡聚糖SephadexG?50北京拜尔迪生物公司，批号17?0043?02，丙二醇天津市富宇精细化工有限公司，批号071012，色谱甲醇天津四友化学试剂厂，超纯水，其余试剂均为分析纯。2方法与结果2.1纳米乳处方挑选2.1.1纳米乳的制备称取适量的药物、油、乳化剂、助乳化剂，搅拌混匀，50水浴加热溶解，得均匀透明的溶液；在磁力搅拌下将此溶液逐滴参加6065蒸馏水中乳化。2.1.2油、外表活性剂种类分别
3、以大豆油、MCT、油酸乙酯为油相，吐温80、泊洛沙姆F68、豆磷脂为乳化剂，考察外观及700nm透光率此波长药物、辅料本身无吸收，透光率仅与乳滴大小成反比，初步挑选乳剂的组成，结果见表1。结果表明：乳化剂与油的质量比为41时，乳化剂的乳化能力由强到弱排列是：吐温80泊洛沙姆F68豆磷脂，故选择吐温80为乳化剂；油相被乳化由强到弱排列是：油酸乙酯MCT大豆油，而MCT已被欧洲药典准许用于注射剂，且已有上市产品12436-439，故选择MCT为油相。表1油相、外表活性剂种类对粒径的影响略br1Effectofoilphaseandsurfactantsonparticlesize2.1.3外表活性
4、剂用量吐温80与MCT按不同质量比，分别以41、31、2.51、21、11混合，按“2.1.1项制备，考察外观及700nm透光率，结果见表2。结果表明：在MCT与丙二醇的量、制备工艺一样前提下，吐温80MCT2.51时能构成微乳。因而，选择吐温80MCT=2.51作为外表活性剂与油最低比例。2.1.4复合乳化剂比例固定吐温80+豆磷脂MCT=2.51，将吐温80与豆磷脂按不同质量比混合，考察方法同“2.1.3项，结果见表3。结果表明：当吐温80豆磷脂21时能构成微乳。为减少吐温80的用量，选择吐温80豆磷脂=21为复合乳化剂比例。2.1.5油浓度固定吐温80豆磷脂MCT=0.250.1250.
5、15，按“2.1.1项制备，考察MCT不同浓度时的包封率。由表4可见，辣椒碱纳米乳包封率随MCT浓度的增大而相应提高，当MCT浓度上升至1.50%，包封率为85.22%，符合药典的相关规定包封率80%。2.2纳米乳制备工艺优化2.2.1乳化温度选择将药物、油、复合乳化剂、助乳化剂按处方量混匀，50水浴加热溶解，得均匀透明的溶液，在磁力搅拌下将此溶液分别逐滴参加6065与常温25蒸馏水中乳化30min。辣椒碱纳米乳包封率结果见表5。结果表明：6065乳化的包封率略高于常温乳化。为简化生产工艺，选择常温25乳化。表2油与外表活性剂比例对粒径的影响略br2Effectoftheproportionb
6、etweenoilandsurfactantsonparticlesize表3复合乳化剂比例对粒径的影响略br3Effectoftheproportionofcompositeemulsifiersonparticlesize表4油浓度对辣椒碱纳米乳包封率的影响略br4Effectofoilconcentrationonentrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion2.2.2油、水滴加顺序将药物、油、复合乳化剂、助乳化剂按“2.2.1项制备均匀透明的溶液，在磁力搅拌下，分别将此溶液逐滴参加25蒸馏水中，以及将25蒸馏水一次倾入该溶液中乳化30min，包封
7、率结果见表6。结果表明：油、水滴加顺序对包封率影响不大。考虑今后工业生产更简单，选择蒸馏水一次倾入油中乳化的方式。表5温度对辣椒碱纳米乳包封率影响略br5Effectoftemperatureonentrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion表6制备工艺对辣椒碱纳米乳包封率影响略br6Effectofpreparationtechnologyonentrapmentefficiencyofcapsaicinnanoemulsion2.3辣椒碱纳米乳注射剂的制备根据辣椒碱纳米乳处方设计与工艺研究结果，结合注射剂的制备工艺，拟定辣椒碱纳米乳注射剂制备工艺如下
8、：按处方量称取辣椒碱、油、乳化剂、助乳化剂，50水浴加热溶解，得均匀透明的溶液；在磁力搅拌下，将常温蒸馏水0.22m滤过灭菌倾入该溶液乳化30min，构成淡黄色、澄清透明的辣椒碱纳米乳。于干净环境下，0.22m微孔滤膜过滤辣椒碱纳米乳，将续滤液灌装在已灭菌的2mL、5mL安瓿中，拉封。将灌封好的辣椒碱纳米乳注射剂121、0.1MPa热压灭菌15min，即得。2.4形态与粒径测定2.4.1形态测定取适量辣椒碱纳米乳，滴在覆有支持膜的铜网上，静止10min后用滤纸片吸干，滴加13磷钨酸溶液于铜网上负染5min，自然挥干，用透射电子显微镜观察并拍摄照片，结果见图1。结果表明:纳米乳剂中的乳滴呈类球形
9、，粒径分布均匀。图1辣椒碱纳米乳透射电镜照片(50000)略Figure1Transmissionelectronphotographofcapsaicinnanoemulsion(50000)2.4.2粒径大小与分布测定取辣椒碱纳米乳适量，采用动态光散射dynamiclightscattering,DLS原理的Nicomp380/ZLS激光粒度/动电位分析仪测定，其粒径与粒度分布见图2。结果表明：辣椒碱纳米乳的平均粒径6.16nm，多分散系数0.307，粒度分布均匀。图2辣椒碱纳米乳粒径分布图略Figure2Particlesizedistributionofcapsaicinnanoemu
10、lsion2.5动电位测定采用电泳光散射electrophoreticlightscattering,ELS法，取辣椒碱纳米乳适量，室温下置Nicomp380/ZLS激光粒度/动电位分析仪测定，动电位分布见图3。结果表明，所得辣椒碱纳米乳电位()平均值为34.0mV。2.6pH值测定测定3批辣椒碱纳米乳的pH值，每批测定3次，取平均值。3批乳剂的pH值分别为5.45、5.43、5.45，符合静脉注射剂对pH值的要求。图3辣椒碱纳米乳动电位分布图Figure2Zetapotentialmicroscopedistributionofcapsaicinnanoemulsion2.7辣椒碱纳米乳含量
11、测定2.7.1色谱条件与系统适应性试验色谱柱为DiamonsilC18250mm4.6mm，5m；流动相为甲醇?菜?擦姿幔寤?比70300.1；荧光检测波长为ex=283nm,em=310nm；流速为1.0mL?min-1；进样量为20L。辣椒碱保留时间12.3min，理论塔板数4156，拖尾因子1.13，峰形对称，色谱图见图4A。2.7.2样品溶液的制备精细称取0.10mg辣椒碱对照品，无水乙醇溶解并定容至10mL，取该液1.0mL，无水乙醇稀释至10mL，摇匀，制得1.0g/mL辣椒碱对照液。精细量取0.004%辣椒碱纳米乳0.30mL约相当于辣椒碱12g，无水乙醇溶解并定容至10mL，超
12、声混匀，制得1.2g/mL辣椒碱供试液。精细量取不含辣椒碱的空白纳米乳0.30mL，同法制得阴性对照液。2.7.3方法专属性考察分别量取对照液、供试液及阴性对照液20L，按上述色谱条件测定，结果表明，空白基质无干扰，且供试液与对照液保留时间基本一致，见图4。图43种样品溶液荧光?HPLC图略Figure4Fluorescence?HPLCofthreesamples2.7.4标准曲线绘制精细称取辣椒碱对照品0.20mg于10mL容量瓶中，无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得20g/mL辣椒碱标准储备液。精细汲取该储备液0.1、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0mL置10mL容量瓶中，
13、无水乙醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度对照液。分别进样20L，按上述色谱条件测定，以对照液质量浓度为横坐标，峰面积A为纵坐标，计算回归方程为：A=4106-224614，r=0.9997，结果表明辣椒碱在0.206.00g/mL范围内与峰面积线性关系良好。以信噪比S/N3计算，测得辣椒碱最低检测限为0.1ng。2.7.5精细度试验取0.1g/mL辣椒碱对照液，连续进样5次，测得平均峰面积为10012711，RSD为0.54%，表明仪器精细度良好。2.7.6重现性试验按上述方法制备浓度为0.8、1.0、2.0、4.0、6.0g/mL的辣椒碱供试液，各3份，以1.0g/mL辣椒碱对照液的峰面积定量
14、，结果各浓度辣椒碱含量平均值为91.10%、94.94%、91.03%、91.01%、90.04%；RSDn=3为0.37%、0.85%、0.25%、0.42%、1.7%，表明本方法重现性良好。2.7.7稳定性试验取供试液适量，分别于室温放置0、2、4、6、8、12、24h后按色谱条件测定，测得峰面积日内RSD为0.32%n=7，表明供试液在24h内稳定。天天测1次，连续测5d，峰面积日间RSD为1.5%n=5。2.7.8回收率试验精细量取0.50mL空白纳米乳15份，分3组，置10mL容量瓶中，分别参加20g/mL辣椒碱标准储备液0.40、0.50、1.00mL，各5份，无水乙醇定容，超声混
15、匀，0.45m滤过，精细汲取续滤液20L按上述色谱条件测定，外标法计算回收率。结果高、中、低浓度平均回收率分别为100.14%、102.56%、107.25%，RSD值分别为1.30%、0.83%、0.58%n5，见表7。2.7.9含量测定精细量取0.004%辣椒碱纳米乳0.50mL，无水乙醇溶解并定容至10mL，超声混匀，得辣椒碱供试液；另精细称取辣椒碱对照品适量，无水乙醇配成2.0g/mL辣椒碱对照液。分别汲取辣椒碱供试液、对照液20L，按上述色谱条件测定，外标法计算含量。结果3个批号辣椒碱含量分别为94.50%、94.55%和94.10%。表7辣椒碱纳米乳回收率略br7Recoveryo
16、fcapsaicinnanoemulsion2.8辣椒碱纳米乳包封率测定包封率测定方法参照文献13:量取0.004%辣椒碱纳米乳0.3mL滴到葡聚糖凝胶柱中心，2000r/min离心5min，洗脱液用无水乙醇溶解并定容至10mL，超声混匀，按“2.7.1项色谱条件测定，将峰面积代入标准曲线计算药物浓度。根据式1-1计算辣椒碱纳米乳的包封率。包封率包封/总药100%1-1式中总药表示辣椒碱总质量浓度，包封表示纳米乳中被包封辣椒碱质量浓度。测得3批辣椒碱纳米乳的包封率分别为85.83%、84.50%、85.34%，RSD为0.79%。见表8。表8辣椒碱纳米乳包封率略br8Entrapmenteff
17、iciencyofcapsaicinnanoemulsion3讨论3.1影响乳滴粒径因素3.1.1油、外表活性剂种类油、外表活性剂种类是影响乳滴粒径的重要因素。根据纳米乳构成机理，当外表活性剂的亲水亲油平衡值HLB与油所需HLB值相当时，构成纳米乳较稳定14。当油、外表活性剂浓度不变，分别以大豆油、油酸乙酯、MCT为油相，构成乳滴粒径由小到大排列：吐温80泊洛沙姆F68豆磷脂。可见，乳化剂乳化能力由强到弱排列：吐温80泊洛沙姆F68豆磷脂。同时，表3结果也表明，乳滴粒径随吐温80增加、豆磷脂减少而逐步减小，讲明吐温80乳化能力较强。制备O/W型乳剂，所需乳化剂的HLB值在816范围内，吐温80
18、的HLB值为15.0；而豆磷脂仅3.0，脂溶性过强，在水相体系中分散性较差，难以在油水两相中很好的分配；相反，泊洛沙姆F68的HLB值为29.012516-519，亲水性强，不能在油水界面大量吸附，也难以构成牢固的界面膜，故乳化能力均较差。油的种类同样影响微乳的构成。如表1所示，吐温80作乳化剂，油酸乙酯或MCT为油相时均能构成透明微乳，而大豆油不能，这可能与大豆油为长链植物油，较难乳化有关。根据文献1518报道，油相分子的大小以及碳链的长短影响微乳的构成：油相分子体积越小，对药物的溶解能力越强；碳氢链越短的油越能嵌入外表活性剂中构成界面膜，所得微乳相图区域越大。反之，碳氢链过长的油则不易构成
19、微乳。因而，油酸乙酯、MCT较大豆油易乳化。3.1.2外表活性剂用量当油、外表活性剂种类固定时，外表活性剂用量显著影响乳滴粒径的大小。如表2所示，吐温80MCT的质量比由11增大到41时，透光率由0.5%增大到99.6%，可见乳滴粒径随外表活性剂用量增大而减小。文献19也讲明，纳米乳中乳化剂的用量为油量的20%30%，而普通乳中乳化剂多低于油量的10%。这是由于纳米乳乳滴小界面积大，外表能高，需要浓度更高的乳化剂才能有效降低外表能，构成纳米乳。但考虑到毒性，在构成纳米乳前提下外表活性剂的用量应尽可能少。新晨3.2影响包封率因素除了油的种类影响乳滴粒径以外，油的浓度是影响纳米乳包封率的关键因素。当MCT由0.15g增大到1.50g时，包封率由20.07%提高到85.22%。这是由于当辣椒碱浓度不变时，增大油的量，乳化剂、助乳化剂按比例增加，药质比随之提高，使更多药物溶解在油、乳化剂、助乳化剂组成的均相中，构成均匀透明的溶液；遇水乳化后药物被包裹的比例随之提高。此外，表5、表6讲明乳化温度与油、水滴加顺序对辣椒碱纳米乳包封率的影响不大。