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1、人原代白血病细胞的体外研究1方法1.1形态学观察原代白血病细胞，调整密度为2105/mL，按每孔2mL接种于6孔板中。实验组参加终质量浓度分别为0.2、0.5、0.8mg/mL的苦参碱药液，阴性对照组参加等体积1640培养液，作用24、48h后倒置光学显微镜下观察白血病细胞形态学改变。1.2苦参碱对原代白血病细胞作用浓度时间曲线的测定原代白血病细胞调整密度为1.5105/mL，按每孔1mL接种于24孔板中。实验组参加苦参碱药液，终质量浓度分别为0.2、0.5、0.8mg/mL，阴性对照组参加等体积1640培养液，每组设6个平行孔。细胞于37、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养。天天各实验组取
2、出1孔，台盼蓝染色计数活细胞，连续计数6次，绘制苦参碱对白血病细胞的作用浓度和时间曲线。每个实验至少重复3次。1.3CCK-8增殖实验原代白血病细胞调整密度为2105/mL，按每孔200L接种于96孔板中。实验组加苦参碱药液，终质量浓度分别为0.2、0.5、0.8mg/mL，另设不加药组为对照组，无细胞单加药组为空白组，每组设3个平行孔。细胞分别培养24、48h后，CCK-8法检测苦参碱对细胞的影响。细胞增殖活性计算公式：实验组A450空白组A450/对照组A450空白组A450100%。每个实验至少重复3次。1.4AnnexinV-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡原代白血病细胞调整密度为2
3、105/mL，按每孔3mL接种于6孔板中。实验组分别参加0.2、0.5、0.8mg/mL苦参碱处理。24h后，收集细胞以预冷0.01mol/LPBS洗涤2次，以100L1Annexin-bindingbuffer重悬细胞，调整细胞数目在1106个/mL，实验组和对照组细胞内依次参加5LAnnexin-V和1LPI工作液；另设Annexin-V和PI单染对照，分别参加5LAnnexin-V或1LPI工作液；避光室温孵育15min，各管内参加400L1Annexin-bindingbuffer，混匀避光至于冰上。以FITC标记的Annexin-V和碘化丙啶propidiumiodide，PI染色流
4、式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。每个实验至少重复3次。1.5细胞周期分析原代白血病细胞调整密度为2105/mL，按每孔5mL接种于6孔板中。实验组分别参加终质量浓度0.2、0.5、0.8mg/mL苦参碱处理。48h后，收集细胞以预冷0.01mol/LPBS洗涤2次，以500L冰70%乙醇固定细胞，20过夜。后离心弃上清，以预冷0.01mol/LPBS洗涤2次，实验组和对照组细胞内依次参加100LTritonX-1000.1%破膜，5min。后离心弃上清，以预冷0.01mol/LPBS洗涤2次，参加终质量浓度0.2mg/mLRNeA，50g/mLPI，避光室温孵育30min，流式细胞仪检测各组细胞
5、周期情况。每个实验至少重复3次。1.3统计学分析数据用采用SPSS17.0统计软件处理，计量资料以xs表示。组间比拟采用单因素方差分析，并进行组间两两比拟。2结果2.1形态学观察原代白血病细胞经苦参碱处理前后，细胞形态发生明显变化。见图1，对照组经24h培养后，细胞数量略有增加，形态呈圆形透亮状，折光性减弱，胞质中出现细颗粒状物质；而经苦参碱处理24h，细胞数量虽有增加，但胞体胀大，内有空泡，核内染色质固缩，可见死亡细胞及碎片。培养48h后，对照组细胞略有增加，细胞形态胀大，可见些许死亡细胞及碎片；苦参碱处理组细胞数量减少，核内染色质固缩，细胞破裂降解，细胞开场大量死亡。2.2苦参碱抑制原代白
6、血病细胞的增殖活性不同浓度苦参碱对原代白血病细胞的生长均显示抑制作用，呈药物浓度相关性。由图2A生长曲线可见，随着苦参碱处理浓度的增加，细胞的增值速度减慢。苦参碱0.2mg/mL组48h细胞计数为15.331.04104，苦参碱0.5mg/mL组为90.87104，对照组为17.831.26104。随着苦参碱作用时间的延长，处理组细胞数减少愈加明显。5d时，苦参碱0.2、0.5、0.8mg/mL组细胞计数依次为101104、6.671.15104、5.670.58104。随着苦参碱处理浓度的增加，抑制作用逐步加强，见图2B。24h苦参碱处理组细胞活性依次为66.1011.02%、45.0218
7、.21%、27.047.89%。其中0.5、0.8mg/mL与对照组差异显著P0.01。而且0.2mg/mL与0.8mg/mL之间也存在显著差异P0.05。苦参碱处理时间延长后，48h苦参碱0.2mg/mL组细胞活性为79.686.59%，抑制作用有所减弱；苦参碱0.8mg/mL组细胞活性为25.8821.01%，抑制作用略有增加，但是差异无显著性。苦参碱对原代白血病细胞的抑制作用呈剂量相关性，其中苦参碱0.5mg/mL在24、48h均呈现半数抑制。2.3苦参碱诱导原代白血病细胞凋亡苦参碱对原代白血病细胞诱导凋亡作用具有剂量相关性，见图3。苦参碱作用24h，对照组的细胞凋亡率约为8.71%，随
8、着苦参碱加药浓度的增加，细胞凋亡率分别为13.37%、40.62%、63.21%，其中早期凋亡率分别为11.8%、37.6%、54.7%。2.4苦参碱阻滞原代白血病细胞于G0/G1S期苦参碱处理48h后，原代白血病细胞的周期发生改变。其中G0/G1期细胞逐步增加，S和G2期细胞比例显著降低，见图4。G0/G1期细胞逐步增加，其中对照组为74.7%，苦参碱0.5mg/mL组为88.06%，苦参碱0.8mg/mL组为90.4%。S和G2期细胞比例显著降低，S期对照组为8.22%，苦参碱0.5mg/mL组为4.42%。G2期对照组为17.08%，苦参碱0.2、0.5、0.8mg/mL组依次为16.7
9、5%，7.52%，2.48%。显示细胞周期阻滞于G0/G1S期。3讨论白血病是一种造血系统恶性肿瘤，在我国青少年中发病率较高，其高度增生和恶性侵袭的生物学特性使其临床防治始终是一个难点。白血病的常规疗法主要是放疗和化疗，但是由于缺乏选择特异性，往往对正常组织、器官十分是骨髓和消化道造成功能性或器质性损伤。因而，寻找新的治疗方法和有效的抗癌药物具有重要意义。中草药以其副作用小，价廉易得在肿瘤综合防治中越来越遭到关注。苦参碱是提取于豆科植物苦参、苦豆子、广豆根等中草药的活性成分。近年来，有关苦参碱类抗肿瘤机制的研究目前已成为抗肿瘤中药研究的一个热门，研究结果表明作为抗肿瘤联合用药在肿瘤综合防治中具
10、有较好的应用前景。以往研究发现，苦参碱能明显抑制人慢粒白血病细胞K562、早幼粒白血病细胞HL-60、U937细胞增殖，诱导凋亡增加，其中抑制K562细胞内DNA复制；诱导T淋巴细胞白血病JM多个凋亡基因差异表达，其中Cpe8表达上调5倍以上。以上这些都是在白血病细胞株中的研究，苦参碱对原代白血病细胞的作用尚没有更多报道。本研究发现，苦参碱对原代白血病细胞也具有明显的增殖抑制作用，呈剂量相关性。随着时间的延长，其抑制效应有所减弱，但高浓度仍具有较强抑制效果，苦参碱0.5mg/mL在24、48h均呈现半数抑制。细胞凋亡也与肿瘤之间关系密切，正常细胞通过增生和凋亡来维持本身稳定，若两者失衡，则会导
11、致肿瘤发生。本次研究，24h苦参碱诱导凋亡作用显著，其中早期凋亡占较大比例。肿瘤细胞的无限增殖与细胞周期的失控有关，G1/S是其重要的调控点。本次研究，苦参碱处理48h，原代白血病细胞G0/G1期细胞逐步增加，S和G2期细胞比例显著降低，显示细胞周期阻滞于G0/G1S期。本课题组在以往研究中发现，苦参碱能够抑制K562细胞生长，诱导其凋亡、分化，其作用可能与Bcl-2、C-myc、CyclinD1、P53的表达有关。有报道称苦参碱作用后的K562、HL-60细胞Bcl-2蛋白表达明显的下调，与苦参碱浓度呈反比。近年来的研究表明Bcl-2在内源性凋亡途径中起着重要作用。另外，苦参碱作用K562细
12、胞后，P53表达加强。P53是一种肿瘤抑制基因，对细胞生长、凋亡和DNA修复有调控作用。此外，苦参碱作用K562细胞后，伴随着DNA合成能力的降低，C-myc的mRNA水平表达降低，CyclinD1表达加强并几乎同步到达最高。C-myc、CyclinD1作为一种细胞周期蛋白，其表达水平受苦参碱影响，在G0期到S期的经过中起重要作用。因而，揣测苦参碱对原代白血病细胞生长抑制作用可能与Bcl-2，C-myc基因表达水平的下调，CyclinD1表达加强，P53活化有关。以往的研究提供了一些可能，苦参碱抑制原代白血病细胞增殖，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期于G0/G1S期，其作用机制能否与这些分子相关，还有待更深化的研究。这些涉及到的相关分子将是本课题组下一步的研究方向。