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1、林蛙油生物活性肽研究采用响应面法对林蛙油生物活性肽的制备工艺进行优化，并对活性肽进行抗疲惫作用研究。结果表明：超声波辅助酶法制备林蛙油生物活性肽，木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为料液比1%、酶用量0.3%、温度60、时间4h、pH5.5，水解度为13.5%。动物试验结果表明：高剂量组小鼠的负重游泳时间是对照组的2.3倍，低剂量组的转棒时间是对照组小鼠的2.73倍，中剂量组小鼠的爬杆时间是对照组的2.8倍；小鼠的血清尿素氮和血乳酸含量分别减小了72.7%和86.5%，讲明林蛙油生物活性肽能够缓解疲惫感的产生。关键词：林蛙油；生物活性肽；抗疲惫作用随着生活节拍的加快及工作压力的增加，人们越来越容易感觉到
2、疲惫，这种现象与机体能量消耗和状态修复有直接关系1-4，疲惫现象产生后，能够导致机体运动能力降低、中枢神经系统驱动源减少、神经肌肉接点效率降低等5，如不及时对疲惫现象进行状态修复会对机体的骨骼肌、心肌等造成危害6,7，如慢性疲惫综合症CFS就是由于疲惫现象所引起的疾病8,9。生物活性肽作为一种天然制备产物无毒副作用备受关注，研究表明生物活性肽具有抑菌、抗癌、抗疲惫、抗氧化、降胆固醇等生理功能10-12。林蛙油味甘、性平，系雌性林蛙的枯燥输卵管，其主要成分是蛋白质，研究表明，蛋白质在人体内要水解为小分子肽才能更好的发挥其生理作用，因而本研究采用酶工程的方法以林蛙油为原料将其水解为肽类物质，并通过
3、动物试验研究其抗疲惫作用。1材料和方法1.1试验材料与仪器设备1.1.1试验材料林蛙油长白山北亚药业有限公司；木瓜蛋白酶400U/mg，购自上海鼎国生物工程有限公司；其他均为分析纯，购自上海鼎国生物工程有限公司。尿素氮试剂盒，购自长春汇力生物技术有限公司；血乳酸试剂盒，购自南京建成生物技术有限公司。1.1.2仪器设备infinitieM200酶标仪，NanoQuant；FE20KpH计，瑞士梅特勒；Z36HK型高速离心机，德国HERMLE公司；FD-1B50型冷冻枯燥机，北京博医康仪器有限公司；UV-1700型分光光度计，日本岛津。1.2方法1.2.1林蛙油生物活性肽的制备工艺准确称取适量林蛙
4、油，根据一定料液比混合发制，打浆，超声波400W处理30min，进行木瓜蛋白酶水解，4h后沸水浴灭酶15min，冷却后4500r/min离心15min，将上清液冷冻枯燥备用13。1.2.2茚三酮法测定林蛙油生物活性肽的水解度DH14将烘干至恒重的甘氨酸稀释成2-20g/mL的溶液用于绘制标准曲线横坐标；取2mL稀释液和1mL显色剂于试管中，充分混匀后沸水浴加热15min，同时作空白对照；15min后取出试管冷水迅速冷却，参加5.0mL40%乙醇溶液混匀后放置15min，用1cm比色杯以空白对照管调零于570nm处测其吸光度作为标准曲线的纵坐标。取蛋白水解液0.5mL定容在50mL容量瓶中，取出
5、4mL稀释液与1.6mL蒸馏水、1.0mL显色剂混匀于试管中，操作同标准曲线，即可计算出蛋白水解液中-NH2的含量mol/mL。1.2.3林蛙油生物活性肽的抗疲惫能力评价1.2.3.1动物分组ICR小鼠，体重18-22g，雄性。购自吉林大学基础医学院实验动物研究中心；试验设三个剂量组和一个对照组，给药剂量分别为：低剂量100mg/kg，中剂量200mg/kg，高剂量400mg/kg，对照组给予蒸馏水，给药方式为灌胃，受试样品给予小鼠时间为30天。1.2.3.2小鼠负重力竭游泳抗疲惫试验采用50cm50cm40cm游泳箱，水深30cm，水温251.0，末次给予受试样品30min后，将尾根部负荷5
6、%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。记录小鼠自游泳开场至死亡的时间。1.2.3.3转棒疲惫试验在1.2.3.1中试验动物末次给药后30min上转棒疲惫仪，记录小鼠在棒时间。1.2.3.4爬杆试验在1.2.3.1中试验动物末次给药后30min进行爬杆，记录小鼠在杆时间。1.2.3.5血清尿素氮测定在1.2.3.1中试验动物末次给予受试样品30min后，在温度30游泳箱中不负重游泳90min，休息60min后，眼球采血。分离血清，根据试剂盒操作方法测定各组小鼠血清中尿素氮含量。1.2.3.6血乳酸测定在1.2.3.1中试验动物末次给予受试样品30min后，采血20L，在温度为30游泳箱中不负重游泳1
7、0min，立即采血20L，休息20min后，立即采血20L。按试剂盒操作方法测定不同时间小鼠全血中乳酸含量。1.2.4统计处理采用GraphPadPrism软件系统处理试验数据，试验结果以平均数标准差的形式表示，利用方差分析和t检验等方法对所获结果进行统计学的分析。P0.05被以为有统计学意义。2结果与讨论2.1木瓜蛋白酶水解林蛙油工艺条件2.1.1料液比对水解工艺的影响配置料液比分别为0.5:100,1:100,1.5:100,2:100,2.5:100林蛙油蛋白溶液，经超声波预处理后按加酶量0.3%，酶解时间3h，酶解温度60处理样品，研究料液比对水解工艺的影响。图1为不同料液比条件下，林
8、蛙油水解度的变化。由图可知，随着料液比的变化对水解度的影响很大，随着料液比从0.5:100增加到1:100时，林蛙油水解度迅速增加，并到达最高值；随着料液比的继续增大，林蛙油水解度逐步减小，讲明太多的蛋白质分子会构成网状聚合物抑制酶解反响，所以水解林蛙油生物活性肽适宜的料液比为1:100时。2.1.2加酶量对水解工艺的影响从图2可知随着加酶量的升高，水解度也随之增大；当加酶量在0.3%时，林蛙油生物活性肽的生成率到达了一个稳定水平，此时酶将蛋白分子几乎完全催化断裂，随着加酶量继续升高，对水解度的影响也不显著。所以，林蛙油生物活性肽的水解工艺中最适加酶量为0.3%。2.1.3酶解时间对水解工艺的
9、影响如图3所示，随着酶解时间的延长，水解度也越来越高，酶解反响在1h到4h之间水解度一直呈上升趋势，4h后上升趋势明显变缓不利于蛋白水解，可见反响在4h时已趋于稳定。所以选择酶解时间为4h为最佳条件。2.1.4pH对水解工艺的影响由图4可知，pH值从4.5增加到5.5，水解度呈上升的趋势，当pH值从5.5增加到6.5时，水解度呈下降趋势，讲明林蛙油在水解工艺中的适宜pH值为5.5。在单因素试验的基础上运用响应面法优化水解工艺条件，考察料液比、加酶量、酶解时间和pH值对水解工艺的影响。2.1.5响应面法优化木瓜蛋白酶水解林蛙油工艺本研究在单因素试验的基础上确定各影响因素水平范围，进而优化林蛙油生
10、物活性肽的制备工艺，为林蛙油提高水解率提供相关的理论根据。响应面试验因素水平与编码表1以及试验结果表2如下表所示：由表3方差分析结果可知，本试验所建立的模型显著P=0.02410.05,失拟项不显著P=0.15020.05，讲明该模型拟合程度较好，可用于木瓜蛋白酶水解林蛙油工艺条件的分析和预测。方差分析还表明，回归模型中A、C2对Y值的影响极显著，A2、B2对Y值的影响显著。根据DesignExpert8.0.6软件分析可得响应面的3D和等高线图，如图5所示。经分析可知，制备林蛙油生物活性肽的最佳条件是：加酶量0.3%，料液比为1:100，酶解时间为4h，pH为5.5，此时林蛙油水解度为13.
11、5%。为验证模型的准确性，在最佳制备工艺条件下进行3次平行试验的平均值为13.32%，与预测值相近，表明响应面法所得的模型准确可靠。2.2林蛙油生物活性肽对小鼠的抗疲惫作用2.2.1林蛙油生物活性肽对小鼠负重游泳的影响负重力竭游泳试验不仅能够体现机体的抗疲惫能力，还能反响出机体对外界不良环境的抵抗能力和应激能力。由表4可知，低、中、高剂量组小鼠在负重力竭游泳试验中均比对照组游泳时间长，其中高剂量组效果最为明显p0.001，是对照组的2.3倍。各剂量组能够显著延长运动小鼠负重力竭游泳的时间，亦可讲明林蛙油生物活性肽具有一定的抗疲惫成效。2.2.2林蛙油生物活性肽对小鼠转棒疲惫试验的影响小鼠在转棒
12、仪上的转动时间，是考验小鼠抗疲惫效果的一个重要指标，如表4所示，给予林蛙油生物活性肽的低剂量组小鼠比未给予林蛙油生物活性肽的小鼠具有十分显著差异，低剂量组的转棒时间是对照组小鼠的2.73倍，讲明林蛙油生物活性肽具有抗疲惫成效。2.2.3林蛙油生物活性肽对小鼠爬杆试验的影响由表4可知，与未给予林蛙油生物活性肽的对照组相比，低剂量组和高剂量组的小鼠均具有显著延长爬杆时间，低剂量组、高剂量组差异显著p0.05，中剂量组差异达极显著p0.01，是对照组的2.8倍，由此可见林蛙油生物活性肽能显著延长小鼠的爬杆时间。2.2.4血清尿素氮测定机体在连续运动经过中，由于处于缺氧状态下会造成乳酸和氨的蓄积，导致
13、疲惫感产生15,16；乳酸脱氢酶作用于丙酮酸后生成血乳酸，在能量供不应求时，蛋白质分解代谢产能生成血清尿素氮。如表5可知，在游泳90min后对照组小鼠的血清尿素氮含量为5.93mmol/L，低剂量组中血清尿素氮含量继续增加至8.96mmol/L，是对照组的1.5倍，讲明小鼠剧烈运动会提高血清尿素氮水平，疲惫感急剧加增；中剂量组、高剂量组与对照组相比，分别减小了26.3%和72.7%，并且中剂量组与对照组之间差异显著p0.05，高剂量组与对照组之间具有极显著差异p0.01。结果表明，灌胃林蛙油生物活性肽能够供应机体能力，提高小鼠的抗疲惫能力，亦具有一定的抗疲惫成效。2.2.5血乳酸测定在长时间剧烈运动经过中，肌肉耗氧量的增加会导致机体缺氧状态加速糖酵解产生乳酸，所以乳酸含量越高，疲惫感就越强17,18。表6是分别测定小鼠在游泳前、游泳时、游泳后血乳酸含量，结果表明：游泳前中剂量组的血乳酸相比于对照组减小了86.5%，效果极其显著；游泳后，高剂量组相比于对照组减小了50%，具有差异显著性。本研究优化了林蛙油生物活性肽的制备工艺，通过响应面优化工艺为：木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为料液比1%、酶用量0.3%、温度60、时间4.0h、pH5.5，水解度为13.5%。通过动物试验表明，林蛙油经过木瓜蛋白酶水解后具有抗疲惫功能。