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1、卵巢癌细胞迁移侵袭讨论1材料与方法11实验材料人卵巢透明细胞癌细胞ES-2购自上海中科院。pEGFP-C3-41N质粒和pEGFP-C3质粒由美国纽约血液中心DrXiuliAn惠赠。McCoys5A培养基购自茂健联星公司。FBS购自北京元亨金马公司。Trizol、转染试剂Li-pofectamine2000购自美国Invitrogen公司。G418购自美国默克公司。枸橼酸抗原修复液、异丙醇、无水乙醇等购自鼎国生物公司。免疫组化二抗及DAB显色试剂盒购自美国Dako公司。Transwell小室购自Corning公司。Matrigel胶购自美国BD公司。IPA裂解液、蛋白酶抑制剂、蛋白BCA定量检
2、测试剂盒、ECL发光液均购自普利来公司。人41N兔多克隆抗体由美国纽约血液中心实验室惠赠。抗-actin鼠单克隆抗体、HP标记羊抗兔(鼠)IgG二抗购自中杉金桥公司。Vimentin、E-Cadherin、N-Cadherin、Twist、Slug抗体购自美国Epitomics公司。FastQuantTKit和SuperealPreMixPlus均购自天根生物公司。12方法121免疫组化选取卵巢子宫内膜异位组织标本25例和卵巢透明细胞癌29例。切片常规脱蜡、抗原修复，3%双氧水孵育，滴加兔抗人41N抗体，4过夜后TBS冲洗，滴加二抗，37孵育30min。TBS冲洗，DAB显色。苏木素复染，梯度
3、乙醇脱水，中性树胶封片，光学显微镜下观察照相。41N免疫组化染色阳性结果为胞质内出现棕褐色颗粒或染色。切片均由2名有经历的病理科医师采用双盲法评估算分。结果断定:采用半定量评分标准，在高倍镜下与周围间质相比，无着色记为0分，浅褐色记为1分，褐色记为2分，深褐色记为3分;阳性细胞百分率10%记1分，10%80%记2分，80%记3分。两者相乘为综合染色强度评分。02分为表达缺失，36分为表达降低，9分为表达正常。122细胞培养与转染人卵巢癌细胞株ES-2常规培养于含10%胎牛血清的McCoys5A培养液中，置37、5%CO2培养箱孵育。待贴壁生长24h、细胞融合度约90%时胰酶消化，按1105细胞
4、/ml重新接种至6孔板，培养1824h后进行转染。采用脂质体转染试剂Lipofectamine2000将pEGFP-C3-41N质粒(41N组)和pEGFP-C3质粒(Con-trol组)分别转染至细胞。转染6h后，更换新培养基，37、5%CO2条件下，置培养箱培养。24h后加适当浓度G418挑选，710天后，半量G418挑选浓度维持培养，最终得到稳定转染细胞株。以Westernblot和实时荧光定量PC(qT-PC)方法检测转染效率。123划痕实验观察细胞的迁移能力稳定转染细胞接种于6孔板，培养约24h。用10l枪头在6孔板底部轻划构成划痕，PBS洗去漂浮细胞并换成无血清培养液，置37、5%
5、CO2孵箱培养。0、6、24h观察拍照。用Image-J软件随机量取各图的划痕宽度3次，并计算迁移率:(0h划痕宽度6h/24h划痕宽度)/0h划痕宽度。每组设置3个重复孔，实验重复3次。124Transwell迁移及侵袭实验将基质胶用无血清的DMEM培养基18稀释，加Transwell小室滤膜内外表，20l/室，37放置1h。将密度为5104的细胞悬液200l加至transwell上室，下室加600l完全培养基。5%CO2、37培养箱孵育24h后取出。PBS冲洗膜，用棉签将微孔膜上层的细胞擦去，下室用4%多聚甲醛固定10min，HE染色，镜下随机取6个不同视野计数移至微孔膜下层的细胞。实验重
6、复3次。125qT-PC检测41N、Claudin4、ZO-1、Twist、Slug、ZEB-2、MMP-2和MMP-3mNA表达水平TIzol提取细胞总NA，按FastQuantTKit讲明进行逆转录合成cDNA。引物序列见表1。qT-PC反响按SuperealPreMixPlus试剂盒讲明配置体系并在iQ5eal-TimePCDetectionSystem上运行。结果分析采用2CT方法，每组实验重复3次。126Westernblot法检测41N、E-cadherin、N-cadherin、Vi-mentin和Twist蛋白的表达IPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，计算上样体
7、积。根据目的蛋白的分子量选择适宜浓度的凝胶进行电泳。上样于10%SDS-PAGE电泳分离后转至硝酸纤维素膜，封闭2h，一抗4孵育过夜，TBST洗膜3遍，加相应二抗，室温孵育1h后TBST洗膜3遍，利用Bioadimagingsystem采用ECL发光显影。13统计学处理采用SPSS统计学软件。采用GraphPadprism5对数据进行绘图分析。采用Fisher准确检验，Wilcox-on秩和检验和t检验。P005为差异有统计学意义。2结果2141N蛋白在卵巢透明细胞癌组织中表达下调免疫组化结果显示，与异位子宫内膜相比，41N在卵巢透明细胞癌组织中表达显著降低(1296%vs4630%，P000
8、01)，见图1。Westernblot结果显示，转染后，41N组中41N蛋白和mNA水平较对照组显著增高，差异有统计学意义(P00001)。2241N负性调控卵巢透明细胞癌细胞的迁移和侵袭能力与对照组(Control)相比，41N组癌细胞的水平迁移能力在划痕6h及12h均明显降低(P001)，癌细胞的迁移和侵袭能力均明显遭到抑制，差异均有统计学意义(迁移细胞数:(788058)细胞/视野vs(1675119)细胞/视野，P00001，侵袭细胞数:(350050)细胞/视野vs(625067)细胞/视野，P=0004)。见图3、4。2341N对部分严密连接蛋白、EMT转录因子和MMPs表达水平具
9、有调控作用qT-PC结果显示，与对照组相比，41N组中严密连接蛋白Clau-din-4(P=00013)和ZO-1(P=00015)的mNA水平明显上调，分别是对照组的236005倍和1875068倍，Twist、Slug、ZEB-2mNA、MMP-2和MMP-3mNA明显下调，分别是对照组053004、037000、045006、068006和071011。Westernblot检测结果显示，41N组中Twist蛋白明显下调，差异均有统计学意义(P005)。见图4。3讨论本研究初次发现，41N蛋白在卵巢透明细胞癌中存在显著性表达缺失，并能抑制透明细胞癌肿瘤细胞的体外迁移和侵袭能力。卵巢透明细
10、胞癌易复发、出现化疗耐药及腹膜后淋逢迎转移是导致患者治疗效果不佳和高死亡率的主要原因之一。Kur-man等9结合分子遗传学和病理组织形态学，提出了卵巢癌细胞起源的新观点，以为绝大多数看起来原发于卵巢的癌实际上起源于卵巢外组织，卵巢只是继发受累部位;并且随着组织学类型的不同，肿瘤细胞的起源与发病机制亦不一样，即卵巢肿瘤的发生存在异质性。近年研究表明，卵巢透明细胞癌与子宫内膜异位病灶密切相关，且越来越多的证据支持绝大部分子宫内膜异位症是由经血倒流而产生的。我们有理由以为，透明细胞癌来源于子宫内膜(苗勒氏源性)并种植于卵巢，卵巢是继发受累的11。此外，在子宫内膜异位症患者在位内膜中，发现了包括癌基因
11、通路激活等内在的分子异常，这些变化都使得子宫内膜组织得以种植播散到腹腔、卵巢外表成为可能。这也是我们实验选取异位子宫内膜组织而没有选取正常卵巢上皮的原因。相较于异位子宫内膜组织，卵巢透明细胞癌组织中41N的缺失讲明了41N的潜在的抑癌作用。本研究利用细胞及分子生物学实验手段初次发现，在卵巢透明细胞癌的演进中，尤其是肿瘤细胞的迁移与侵袭经过中，41N可能扮演着重要的负性调控角色。肿瘤转移是一个复杂经过，往往需毁坏细胞间连接、加强游走能力等。严密连接位于上皮细胞和内皮细胞连接处，处于连接复合体的最顶端，在保持细胞极性以及协助信号传导等经过中发挥重要作用，其组成包括Claudins、Occludin
12、s及ZO蛋白等。这些蛋白在肿瘤发生发展中的详细作用环节还有争议，但严密连接完好性的毁坏可能是导致肿瘤细胞发生迁移的原因之一。Shang等发现，Clau-din-3和Claudin-4表达缺失的EOC病例往往预后不良。本研究结果显示，41N可上调Claudin-4和ZO-1表达，进而至少部分解释了生物学行为实验中41N对肿瘤细胞迁移的抑制作用。肿瘤转移经过中，涉及多种机制，包括EMT、失巢凋亡抵抗等。EMT能促进肿瘤细胞发生转移，与患者的不良预后、化疗耐药及靶向治疗耐药均相关。除经典的cadherin-switch(即E-cadherin下调和N-cadherin上调)现象外，相关转录因子Twi
13、st、Slug及ZEB-2等也会被激活。预实验结果显示，在ES-2细胞中转染41N后，E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表达量都没有出现明显改变。本实验虽未出现cad-herin-switch，但结果提示41N可能通过抑制Twist、Slug及ZEB-2表达进而调节下游分子进而发挥抑癌作用。Twist已被证明在很多肿瘤发展中起着关键性的作用，如抑制E-cadherin的表达和下调Claudin-4。本实验结果显示，41N过表达导致了Twist下调和Claudin-4上调，后者既可能是41N的直接调控结果，可以能是抑制Twist表达后的继发改变。2013年GilMo
14、r研究小组发现，Twist1在EOC干细胞的分化和转移中扮演着重要的角色，提示在卵巢癌中Twist的作用机制是多样而丰富的，进而41N对其的干涉进而产生效应也是多因素共同作用的结果。除Twist外，Slug对于E-cad-herin的下调进而促进肿瘤发展也具有重要作用，这一经过离不开PI3K/Akt信号通路的激活;反之，抑制PI3K/Akt信号通路能下调Slug进而阻止癌细胞的侵袭。41N也能通过与PIKE(PI3KinaseEnhancer)的互相作用来调节PI3Kinase。本组前期进行的蛋白质谱检测，其结果也支持41N与PI3K之间潜在的作用关系。蛋白质谱结果提示过表达41N能上调多磷酸
15、肌醇-5-磷酸酶的表达。磷酸肌醇-5-磷酸酶是一种PI3K相关的酶类，能促进细胞死亡，提示PI3K信号通路调节可以能是41N在抑制肿瘤演进中扮演一定的角色，但其详细的分子机制仍需进一步探究。侵袭是肿瘤演进经过的另一个重要环节。其中，MMPs能通过降解细胞外基质而对肿瘤细胞的游走能力进行正性调节，其中MMP-2在卵巢癌标本中的表达水平明显高于卵巢浆液腺瘤且与临床分期密切相关。本实验显示，41N对ES-2细胞侵袭能力的抑制，41N可能通过抑制MMP的表达水平，进而起到抑制肿瘤细胞侵袭的作用。综上，41N蛋白介入负性调控卵巢透明细胞癌的演进，详细调控机制可能涉及对严密连接蛋白、上皮-间质转化转录因子和基质金属蛋白酶的表达调控，进而为卵巢透明细胞癌的诊治和预后判定提供了新的线索和靶标。