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1、白花蛇舌草多糖体外免疫分析1.1小鼠巨噬细胞活性测定1.1.1小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备脱颈处死小鼠，称重，无菌取胸腺和脾脏，用PBS冲洗2-3次，研磨过200目铜网，加PBS制备成单细胞，参加红细胞裂解液裂解红细胞，作用15min后，1000r/min离心5min，弃上清液，沉淀用RPMI-1640不完全培养液洗涤2次，置培养皿中37孵育2h，弃掉未贴壁的细胞。用10%RPMI-1640洗涤细胞3次，剩下的贴壁细胞即为制备的巨噬细胞。1.1.2小鼠巨噬细胞代谢试验将巨噬细胞与终浓度为500g/mL、250g/mL、200g/mL、150g/mL、100g/mL、50g/mL、25g/mL、0
2、g/mL的PHDW共同培养24h后，每孔参加MTT20L5mg/mL，375%CO2培养4h后取出，弃上清液，每孔加DMSO100L，微量振荡器振荡5min，酶联免疫检测仪570nm处测定OD值，取3个复孔均值。1.1.3小鼠巨噬细胞吞噬功能试验如“1.2.2.1制备小鼠巨噬细胞，参加96孔细胞培养板内，每孔100L，含2105个巨噬细胞。试验孔参加不同稀释浓度的PHDW，终浓度分别为500g/mL、250g/mL、200g/mL、150g/mL、100g/mL、50g/mL、25g/mL，每个浓度设3个复孔，每孔100L，对照组参加10%RPMI-1640完全养培液，置5%CO2孵箱中，37
3、饱和湿度连续培养24h，然后每孔参加0.1%的中性红生理盐水溶液，每孔100L，继续培养2h。弃上清液，参加DMSO，100L/孔，震荡，酶联免疫检测仪570nm处测定OD值，取3个复孔均值。1.2PHDW对小鼠胸腺和脾脏NK细胞活性的影响1.2.1效应细胞的制备根据“1.2.1.1方法制备小鼠脾细胞悬液，调整细胞浓度为4105个/mL，此细胞悬液即为检测NK细胞杀伤活性的效应细胞。取LLC-PK1细胞悬液稀释，作为靶细胞。1.2.2NK细胞活性测定将已调整好浓度的脾细胞即效应细胞悬液及LLC-PK1细胞即靶细胞悬液各取100L效靶=501，参加96孔板细胞培养中。试验孔参加终浓度分别为500
4、g/mL、250g/mL、200g/mL、150g/mL、100g/mL、50g/mL、25g/mL的PHDW，每个浓度设3个复孔，每孔100L。以RPMI-1640为正常对照，同时设靶细胞自然释放孔，混匀，置5%CO2孵箱37培养4h。孵育结束后，将其置于45min终止反响，吸出上清液，参加DMSO，100L/孔，于酶标仪570nm处测定各孔光密度值，参考波长为630nm。NK细胞杀伤活性=1-OD效靶细胞-OD效应细胞/OD靶细胞100%2结果2.1PHDW对小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞代谢的影响PHDW对小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞代谢的影响结果见表1。从表1能够看出，在25-200g/mL浓度范围
5、内，随着PHDW浓度的增加，小鼠脾脏淋巴细胞代谢显著加强P0.05或P0.01，但随后浓度再增加，代谢反而有所降低，表现为双向剂量效应关系；150g/mL浓度的PHDW可显著促进胸腺淋巴细胞的代谢P0.05；其他各浓度PHDW对小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞代谢无显著性影响P0.05。2.2PHDW对小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞转化的影响2.2.1PHDW对小鼠胸腺淋巴细胞转化的影响见表2。表2结果表明，PHDW对小鼠胸腺淋巴细胞转化无显著促进作用P0.05，对与ConA或LPS协同转化有一定的加强作用，但不显著P0.05。2.2.2PHDW对小鼠脾脏淋巴细胞转化的影响见表3。表3结果表明，PHDW对小鼠脾
6、脏淋巴细胞的转化有极显著促进作用P0.01，浓度为200g/mL时促进作用最强；PHDW与ConA或LPS协同转化也有显著的促进作用P0.05或P0.01，但与LPS协同转化作用强于ConA。2.3PHDW对小鼠巨噬细胞代谢及吞噬功能的影响2.3.1PHDW对小鼠脾脏和胸腺巨噬细胞代谢的影响见表4。由表4可知，PHDW对小鼠脾脏巨噬细胞代谢有极显著的促进作用P0.01，浓度为150-200g/mL时作用最明显，之后随着浓度增加呈现抑制趋势。PHDW对小鼠胸腺巨噬细胞的代谢无显著促进作用P0.05。2.3.2PHDW对小鼠脾脏和胸腺巨噬细胞吞噬功能的影响见表5。从表5可知，PHDW对小鼠胸腺巨噬
7、细胞的吞噬作用无显著性影响P0.05；在100-200g/mL浓度范围内，随着PHDW浓度的增加，脾脏巨噬细胞吞噬功能显著提高P0.05或P0.01，但随后浓度再增加吞噬功能反而有所降低，表现为双向剂量效应关系。2.4PHDW对小鼠胸腺和脾脏NK细胞活性的影响见表6。由表6可看出，PHDW对小鼠胸腺和脾脏NK细胞的杀伤活性有极显著的促进作用P0.01，在浓度为100-150g/mL时，NK细胞的杀伤活性达最大值，随后增加PHDW浓度，NK细胞的杀伤活性反而降低，表现为细胞活性抑制。3讨论淋巴细胞体外转化可反映淋巴细胞功能的强弱，因而测定小鼠淋巴细胞体外转化是研究小鼠细胞免疫功能的重要手段和指标
8、。研究结果表明，25-200g/mL浓度范围内的PHDW对小鼠脾脏淋巴细胞代谢和转化均有显著促进作用P0.05或P0.01，揣测PHDW可选择性加强B淋巴细胞和免疫功能，但对T细胞激活作用不明显，其选择性刺激作用可能与免疫细胞受体特异性有关。PHDW可能是通过与淋巴细胞外表多糖受体相结合，影响淋巴细胞的信息传递经过，进而影响淋巴细胞体外活性。巨噬细胞是机体天然抵抗力的一种重要效应细胞，巨噬细胞吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要指标之一。浓度为100-200g/mL的PHDW对脾脏巨噬细胞代谢以及吞噬功能均有极显著促进作用P0.01，揣测PHDW可能是通过某个分子构造或生物学机制，促进巨噬
9、细胞和病原体或凋亡细胞外表的特定分子构造相结合，进而提高巨噬细胞的吞噬功能9。NK细胞作为一类重要的淋巴细胞，在机体中发挥重要的免疫监视作用。本试验采用LLC-PK1细胞作为靶细胞，检测NK细胞的杀伤能力，结果表明，PHDW能极显著促进胸腺和脾脏NK细胞对靶细胞的杀伤能力P0.01。目前研究已表明IL-2、IL-12、IFN-、TNF-以及白细胞调节素对NK细胞的活化和分化有正向调节作用，体外培养时参加上述细胞因子可明显提高NK的杀伤活性。PDHW有类似这些细胞因子的作用，但诱导NK细胞活性的机理尚不明确，可能与增加细胞黏附分子的表达、提高对NK抵抗靶细胞的杀伤活性有关，详细机制还有待于进一步研究。研究表明，一定浓度范围内的PHDW可提高脾脏和胸腺淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞的体外免疫活性，为PHDW的免疫加强作用机理的深化研究提供了重要思路，也为其作为免疫加强剂的开发应用提供了重要根据。深化揭示PHDW免疫刺激的细胞作用受体及胞内信号转导机制是进一步研究的方向。