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1、普洱熟茶的发酵微生物研究进程摘要：随着以普洱熟茶为代表的后发酵茶的广泛应用，针对发酵茶微生物的研究日益增加。以普洱熟茶为代表，对介入渥堆发酵的微生物研究现状作以综述，重点阐述普洱熟茶发酵经过中主要微生物及其作用，以及微生物的安全性研究现状。关键词：普洱熟茶；优势微生物；霉菌；酵母；安全性黑茶，又称后发酵茶，是我国传统六大茶类中由微生物介入生产加工的一个特殊品类。近些年，云南普洱熟茶、湖南安化黑茶、广西六堡茶和湖北青砖茶等黑茶消费量不断增加，这其中普洱的知名度最高。普洱茶产于我国云南地区，是指以云南大叶种茶叶为原料制成的紧压茶或散茶。普洱茶根据其加工工艺，又分为普洱生茶和普洱熟茶，其中普洱生茶是
2、由鲜叶经过杀青、揉捻、晒干得到晒青毛茶后，直接压制而成：普洱熟茶则在晒青毛茶的基础上渥堆发酵三至四周后制成1。普洱熟茶属于典型的后发酵茶，具有滋味醇和甘甜，汤色红褐亮堂等特点，其微生物发酵工艺是构成其独特品质的关键技术。普洱茶一直被以为是一种健康饮品，很多研究表明普洱熟茶具有降血糖、降血脂等成效2-3。普洱熟茶渥堆发酵经过中的微生物种类、变化规律和主要作用已经被国内外学者广泛研究。随着研究的不断深化，对普洱熟茶中关键微生物的分析也不断有所突破，怎样通过当代微生物技术生产出更有安全保障、品质更为稳定的普洱熟茶成为研究热门，也得到消费者的广泛关注。本文对普洱熟茶中微生物对茶叶品质构成所起的作用及普
3、洱熟茶安全性等热门问题进行综述。1微生物发酵对普洱熟茶品质构成的作用普洱茶经过渥堆发酵，茶叶成分发生了明显变化，茶多酚、儿茶素和茶黄素含量大幅减少，没食子酸、茶红素和茶褐素大量增加，游离氨基酸含量下降，游离糖和水溶性多糖含量增加4。上述成分的改变使得普洱熟茶与未发酵的茶叶相比，儿茶素含量下降，而其所带有的苦涩味显著降低，茶叶的滋味更为醇厚，对肠胃的刺激性也相应降低。除此之外，咖啡因物质含量也有变化，有研究发现发酵初期咖啡因有所降低，随着时间推移，微生物发酵作用的加强，咖啡因逐步增高，黑曲霉、米曲霉、根霉、酵母等微生物能够升高咖啡因在普洱茶中的含量5。上述的成分变化来源于微生物及其代谢产物的作用
4、，这也就是渥堆发酵在普洱熟茶生产经过中起着决定性作用的原因。各类微生物在渥堆发酵经过中产生淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等多种酶类物质，这些酶作用于多酚、大分子糖类物质等底物，一方面有助于茶叶内含物的渗出，增加茶汤滋味和色泽，另一方面构成了新的滋味香气物质，造就了普洱熟茶醇厚甘甜的品质6。同时，由于特有的微生物代谢产物和茶叶成分，普洱熟茶在调节糖类代谢、降脂减肥等方面的成效也被广泛关注7，如由塔宾曲霉、温特曲霉等产生的洛伐他汀对普洱茶的成效起到关键作用。2普洱熟茶发酵经过中的优势微生物及其作用由于普洱茶渥堆经过的微生物来源于环境以及原料鲜叶，因而不同地区、不同原料的普洱茶渥堆经过中的优势微生
5、物种类有所不同，而也正是由于这些不同种群的微生物构成了云南各地普洱茶的不同风味品质。目前研究以为介入普洱熟茶发酵的微生物主要包括：第一、霉菌，如黑曲霉、米曲霉、青霉等；第二、酵母，如Blastobotrysadeninivorans，酿酒酵母；第三、细菌，如凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等；第四、放线菌，如链霉菌等。不同种类的微生物在发酵经过中有着不同作用。目前以为霉菌类微生物是普洱熟茶品质构成的基础。冯玲然研究指出，黑曲霉产生多种水解酶，如葡萄糖淀粉酶、纤维素酶等，其产生的多酚氧化酶能够降低茶多酚含量，减少普洱茶的苦涩味道，且茶多酚可逐步被氧化成茶褐素，进而构成普洱茶不同于其他茶叶的红褐色的亮堂
6、汤色14，有学者以为茶褐素是普洱熟茶的最重要成效成分，发挥了调节糖类代谢、降脂减肥等作用15；一些黑曲霉菌株还能够提高普洱茶的茶多糖含量，研究显示利用这些菌株进行单菌株发酵的茶叶与其原料叶片相比增加了158%的茶多糖含量16，而黑曲霉发酵的普洱茶香气也有明显特点，其沉香中带有花果香气11。米根霉能产生大量果胶酶，茶叶中的果胶会在酶作用下水解成水溶性果胶和其他可溶性糖类，增加普洱茶醇厚口感和甘甜味道14；而少根根霉对于普洱茶香气中的甲氧基苯及其衍生物的含量较高，构成陈香浓厚，滋味甘滑的特点11。米曲霉能够明显提升普洱茶香气和滋味14；灰绿曲霉和青霉也能够降解茶叶中的纤维和果胶，提升醇厚口感17，
7、青霉还能够产生多种酶类及有机酸，可产生葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸、抗坏血酸等。除了上述常被报道的霉菌类微生物外，酵母及细菌在发酵经过中也发挥着至关重要的作用。酵母能够分泌很多活性酶，如蔗糖酶、麦芽糖酶等，还能够代谢产生茶褐素18。近年来，Blastobotrysadeninivorans又称Arxulaadeninivorans被一些研究者以为是渥堆经过中的关键优势菌，具有耐高温和耐盐的能力，能够产生氧化酶，加快氧化或转化茶叶中多酚类物质，促进茶叶风味的转变19。酿酒酵母Saccharomycescerevisiae发酵的普洱茶香气成分中，萜烯醇类化合物及其衍生物，以及甲氧基苯及其衍生物含
8、量较高，因而茶汤滋味醇和甘滑，陈香明显10。普洱熟茶中主要的细菌群落为欧文氏菌属、无色杆菌属、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、鞘氨醇杆菌属、短杆菌属、葡萄球菌属20。其中，芽孢杆菌属发挥了很大作用，尤其在发酵后期能够产生丰富酶类，如多酚氧化酶、过氧化物酶等，进而促进茶多酚类物质经过氧化、缩合构成多聚物，有利于普洱茶品质提高10。此外，放线菌也被以为介入了普洱熟茶的发酵经过，利用烬灰链霉菌Streptomycescinereus等能够缩短普洱茶发酵时间，其发酵的茶叶含有大量的多酚，并有很强的去除DPPH自由基的能力；杆菌状链霉菌Streptomycesbacillaris则能够使发酵茶叶含有大量-氨基
9、丁酸13。多数研究者以为在整个发酵经过中，黑曲霉A.niger始终占据数量上的优势，黑曲霉在发酵初期能够将茶叶中大分子降解成小分子，使得这些物质能够被其他微生物所利用，因而发酵后期酵母、青霉等微生物数量也有增长5。宏转录组学比照分析也表明，普洱茶发酵前期和中期优势微生物都是黑曲霉21。Abea应用PCR-DGGE方法分析后以为普洱茶发酵经过优势菌为黑曲霉和Blastobotrysadeninivorans，霉菌和酵母能利用各种茶叶多糖作为碳源，进行代谢活动，当两者大量繁衍时抑制细菌生长，进而使曲霉和酵母成为优势菌19。张阳采用PCR-DGGE法研究发现黑曲霉、酿酒酵母Saccharomyces
10、cerevisiae和格拉青霉菌P.glabrum是普洱茶发酵的优势菌12。而近年来也有学者提出不同意见，吕昌勇利用宏基因组学进行微生物多样性分析，结果显示细菌是普洱茶发酵经过中的主要菌群，占总微生物的76.26%，真核生物为16.35%22，其中酵母占真核生物的大多数，含量远大于霉菌18。3普洱熟茶中微生物的安全性问题由于普洱熟茶目前的发酵工艺仍属于“自然发酵，开放式的渥堆发酵环境导致了其发酵经过中的不可控程度较高，每批次介入发酵的微生物及发酵程度都不稳定，且近年来，对于普洱熟茶的安全性逐步引来质疑。客观来讲，目前未见公开的普洱熟茶毒性报道，还没有任何科学证据表明普洱熟茶不安全。一些毒理学研
11、究结果对普洱熟茶的安全性持肯定态度：Wu的细胞实验发现普洱茶无细胞毒性与遗传毒性23，动物实验显示普洱熟茶属于本质无毒类食品，且无明显不良反响24。人体试验的急性毒性实验在10g/d的剂量下未发现血液和生理学变化，长期毒性试验也未发现变化25。关于毒素问题，也有大量研究持乐观态度，这些结果指出普洱熟茶不含有赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素、伏马毒素、桔霉素和黄曲霉毒素26-27。另一方面，有研究指出某些介入普洱熟茶发酵的微生物有产毒素能力，值得关注。例如，研究者从普洱茶中检出了黄曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A，呕吐毒素等19。湿仓储存的普洱茶中也被报道检测出了黄曲霉毒素B1、伏马毒素、呕吐毒素和T-2毒素
12、。必须指出，不当的存储环境，十分是南方的一些高湿环境会增加普洱熟茶中产生毒素的风险。在最新的报道中，Zhang对普洱熟茶进行了毒素检测，发现了展青毒素、CycloL-Pro-L-Tyr、灰绿曲霉酰胺、NeoechinulinA、羟基大黄素、枝孢菌素、大黄素、羊茅麦角碱、羊茅麦角碱A、羊茅麦角碱C、百脉根甙、畸形素C、霉酚酸、大黄素甲醚、松萝酸和玉米赤霉烯酮等25种有毒化合物。研究显示展青毒素含量高，但尚不确定展青毒素的来源。CycloL-Pro-L-Tyr化合物由溶杆菌和互隔交链孢霉产生，从所有的普洱熟茶样品均被检出。灰绿曲霉酰胺是一种由帚状曲霉产生的毒素，所有的实验茶样中均被检出。Neoec
13、hinulinA化合物是一种吲哚生物碱，由一些散囊菌属微生物产生，所有茶样中均被检出28。此外，其他研究也显示普洱熟茶存在真菌毒素，Haas曾在4个样品中检出赭曲霉毒素A26。Zhu发现呕吐毒素在普洱茶中的检出比例高达90%，即70个样品中有63个样品检出27。一些研究者从普洱熟茶中发现了能够产真菌毒素的微生物菌株，例如部分黑曲霉、局限曲霉和桔青霉产毒株。但发酵微生物与茶叶中毒素的关系尚未经过系统研究，一些研究指出茶叶所包含的常见产毒菌株在发酵经过不会产生毒素。例如，李亚莉将黄曲霉接种在普洱茶叶中，发酵结束后未从实验组茶叶中检出黄曲霉毒素29；Zhang在茶样中检出能够产生赭曲霉毒素的黑曲霉和
14、赭曲霉，但未在茶样中检出赭曲霉毒素28。针对上述现象，学界有不同的解释。有研究表明普洱茶中的黑曲霉能够抑制黄曲霉的生长和产毒，并且能够降解黄曲霉毒素B130；也有观点以为茶叶中的氨基酸或多酚类等成分能够抑制产毒微生物产生真菌毒素类物质，如Mo以为茶叶提取物能够阻止菌株产生黄曲霉毒素，但不抑制黄曲霉的生长31。4讨论关于普洱熟茶中微生物种类、功能及其安全性的研究已经成为了茶行业，乃至发酵行业的一个研究热门。目前关于普洱熟茶的微生物种类和安全性的相关研究不少，但结果重复性差，甚至相互矛盾，究其原因，是普洱熟茶的发酵尚属于一个没有标准化控制的自然发酵工序，即使同一普洱工厂不同批次普洱熟茶也会存在差异
15、，其发酵经过的微生物种类、数量并不可控。生产环境的变化，季节的更替等自然因素的变化也会导致普洱熟茶发酵经过中菌群的波动。因而，只要将微生物和工艺领域的研究与普洱茶产业愈加严密地结合起来，才能获得更有讲服力和价值的数据。普洱茶，十分是经过发酵的普洱熟茶已经成为了我国茶产业，甚至是健康产业的重要组成部分。作为一种发酵食品，普洱熟茶的独特风味和健康成效逐步被更多人接受。在保留传统制茶技艺的同时，将普洱熟茶的发酵工艺做得愈加规范，将更先进的发酵理念、工艺技术和评价手段引入这一传统行业势在必行。首先，普洱熟茶发酵经过中的微生物分析有待进一步完善。结合非培养技术，如宏基因组或高通量测序等技术手段，总结微生
16、物生长消亡规律，探明微生物生态系统的动态变化以及各种微生物在发酵经过中的作用，明确哪些微生物是构成普洱茶品质的核心，存在哪些较易污染的潜在产毒菌株；第二，分析普洱熟茶的独特健康价值，说明其中核心的成效成分组，为指导生产、选育菌株、开发工艺提供基础理论根据；第三，现阶段应该加强产品毒素和致病菌的监控，在生产环节加强卫生监督，并研制和开发清洁化生产工艺和设备，利用经过完好安全性评价的发酵菌株进行干涉强化，甚至是接种发酵，最大化地消除环境不可控带来的食品安全风险，将目前开放式的自然发酵工艺升级为有质量控制和检测标准的标准化生产工艺。普洱熟茶是我国传统后发酵茶的代表，微生物及配套发酵工序通过改变茶叶成分，使普洱熟茶构成了其独特品质。通过不断改进生产工艺，加强质量控制，建立普洱熟茶的品质及安全标准，推动茶叶发酵产业升级，是进一步做大做强我国茶产业的关键。