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1、圆齿野鸦椿朔果着色及呈色讨论摘要：为讨论圆齿野鸦椿朔果果皮色素的变化及其呈色经过，以不同发育时期圆齿野鸦椿的果皮为试材，首先进行果实颜色的数字化描绘，然后对叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮和花青素含量进行测定及分析。结果表明：圆齿野鸦椿果实逐步变红与典型色域的CMYK形式中M洋红、Y黄色值关系密切，M值与叶绿素和类胡萝卜素含量呈显著负相关，而与花青素含量呈显著正相关；在果实发育经过中，叶绿素和类胡萝卜素的含量均呈逐步下降的趋势，且两者呈显著正相关；花青素则出现逐步上升的趋势，与其它色素含量呈负相关；类黄酮含量出现降升降的S型变化趋势，与叶绿素和类胡萝卜素均呈显著正相关，而与花青素呈负相关。综上所述，
2、圆齿野鸦椿果实由绿转红的经过中，伴随着叶绿素、类胡萝卜素的降解和花青素的积累。关键词：圆齿野鸦椿；果皮；色素；呈色分析圆齿野鸦椿EuscaphiskonishiiHayata为省沽油科Staphyleaceae野鸦椿属Euscaphis植物，是赏药两用的优良乡土树种。传统及当代医学研究表明，圆齿野鸦椿果实有很好的抗癌及抗炎症等作用，其根、花、干果均可入药1。而且近年来，圆齿野鸦椿开场用作观赏植物2-3，最突出的观赏部位是果实，其挂果期长达6个月，满树的红果横跨秋冬季节，可为秋冬季节增添很多喜庆的色彩，被以为是极具开发潜力的秋冬季观果树种。目前，有关圆齿野鸦椿的相关研究仅集中在繁衍技术4、化学成
3、分研究5和药理研究6等方面，而有关果实着色机制的研究未见报道。在果实发育经过中，果实的呈色与叶绿素Chlorophyll、类胡萝卜素Carotenoid和类黄酮Flavonoid的种类和含量比例有关7。通常，果实在幼果时为绿色，成熟后则呈现多彩的颜色，这是由于随着果实的成熟，果实细胞中的叶绿素不断降解，黄色、橙色果实中的类胡萝卜素和紫色、红色果实中的花青素Anthocyanin属于类黄酮物质的不断积累的结果8。果色是影响经济果品经济价值的重要因素之一，在各类果树中已引起广泛关注，如猕猴桃9、柑橘10和荔枝11等，同时果色作为园林观果树种最重要的观赏性状之一，果实变色机理已在秋海棠12、南天竹1
4、3等观果植物进行过研究，但圆齿野鸦椿作为极具观赏价值的观果树种，其朔果发育经过中果实生长发育和色泽变化方面的变化机理未见报道。现今，广泛应用的园林观赏植物均具多元化的观赏性，单一的叶色、花色、果色等已不能知足人们的观赏需求，于是利用分子手段人工调控观赏性状逐步成为园林观赏植物的研究趋势。因而，本文研究圆齿野鸦椿朔果7个时期的色素和色泽变化，以讨论其果实色素与呈色的变化规律，为深化研究圆齿野鸦椿果实颜色调控机制、选育圆齿野鸦椿新品种提供理论根据及技术支持，也为利用分子生物手段改进品种提供生理学基础。1材料与方法1.1试验材料在福建清流灵地镇选择3株生长基本一致且集中生长的圆齿野鸦椿作为试验样株，
5、圆齿野鸦椿果实采样于6月末11月初进行，共采集7个阶段盛花期后50、70、100、115、130、160、180d圆齿野鸦椿果实。将一部分圆齿野鸦椿的果皮和种子进行分离，一部分用锡纸包住，冻存于干冰中，运回实验室后马上用液氮速冻存放于-80冰箱备用。一部分用60鼓风枯燥箱烘干至恒质量，并称取干质量，另外再摘取新鲜的果实存于装有冰袋的冰盒中，运回实验室后马上用相机拍摄整体果实外观、内果皮和外果皮。1.2试验方法1.2.1果实颜色数字化描绘在晴天光线充足的环境下用同一相机拍摄。相机机身为Nikon/尼康D810，镜头Nikon7mmF2.8微距镜头。相机设置：光圈优先，镜头光圈F8，白平衡设置为日
6、光形式。背景纸选用白色A4纸。颜色数字化描绘参照李欣等14的方法。打开Photoshop图像处理软件，选取CMYK形式命令，添加试材图像到选区，选取果实两侧的中间部位，从顶端到果梗的前端进行切割，切割的果长乘以黄金分割点0.618从顶端开场算起，得到待测区域，再用吸管汲取外果皮、内果皮和种皮典型色域的颜色，得出C青色、M洋红色、Y黄色、K黑色的百分比值。1.2.2果实色素的初步分析1.2.2.1色素类型的定性分析取不同发育时期的果实，经液氮研磨后各取0.1g于10mL离心管中，分别参加石油醚、10%盐酸溶液、30%氨水5mL，观察颜色变化并进行记录。1.2.2.2类黄酮的显色反响测定方法参照智
7、雅静等15的方法，取不同烘干果皮粉末各0.10.005g，分别用盐酸HCl化甲醇MeOH溶液HCl与MeOH体积比为199提取15h，过滤，定容至25mL，各取2mL提取液，进行下面9种显色反响：浓盐酸-锌粉反响；浓盐酸-镁粉反响；三氯化铁反响；三氯化铝反响；氨性氯化锶反响；硼酸反响；浓硫酸反响；碱性试剂反响；硼氢化钠反响。1.2.3果皮色素的定量分析参照高俊凤的方法16测定叶绿素和类胡萝卜素的含量；采用热浸提法测定圆齿野鸦椿果实的类黄酮含量，详细方法参照吴清韩等17的方法；采用超声辅助的pH示差法测定圆齿野鸦椿果实的花青素，详细方法参照杨敏等18和吴春太等19的方法。2结果分析2.1果色的数
8、据化描绘随着果实的成熟，外果皮的C、M、Y、K值变化差异显著，见图1、图2。由图1、图2可知，K值始终保持低值，在盛花期后5070d的C、M、Y值大小依次为：YCM，在70d之后则呈现YMC，讲明在外果皮绿色期C、Y值对色彩的变化起决定作用，而外果皮从红绿相间到全红，是M、Y值起决定作用。在果实发育经过中，内果皮的C、M、Y、K值的变化呈现出一定的规律，在7个发育阶段中K值均接近0，而Y值基本处于高值。随着果实的成熟，C值呈逐步下降的趋势，在盛花期后70d就低于M值，而M值则逐步升高，并在盛花期100d超过Y值，之后均保持高值。即，在盛花期后50d时，C、Y是内果皮呈现嫩绿色的主要原因，在盛花
9、期后70180d内果皮由粉绿相间逐步变成全红，是由M、Y值起决定作用。圆齿野鸦椿种皮颜色的变化是观测果实成熟的重要指标。在盛花期50d，其种皮为乳白色，C、M、K、Y均为最小值；盛花期后70d，种皮为棕色，其K值接近0，C值略大于50d，而M、Y值则呈现激增的现象，讲明种皮棕色与M、Y值关系密切；盛花期后100115d，属于棕黑相间的时期，期间C、K值逐步升高，Y值逐步下降，而M值则先降后升；盛花期115180d，属于C、K值先急剧增大后趋于平稳，且C、M、Y、K值互相间逐步接近，讲明C、K值对种皮颜色加黑有决定性作用。2.2果实色素类型的特征颜色反响在石油醚反响中，若提取液出现黄色，讲明果皮
10、中可能含有类胡萝卜素。本试验中，7个发育时期的圆齿野鸦椿果皮的石油醚显色反响都出现无色，讲明类胡萝卜素含量极低或者不含类胡萝卜素。在10%的盐酸测试中，若提取液呈现红色，则讲明果皮中可能含有花青素。本试验中，提取液出现无色、粉色、红色3类颜色。其中，盛花期后5070d为无色，讲明不含花青素或花青素含量极低；盛花期后100115d出现淡粉色和粉色，讲明花青素含量较低；盛花期后130180d表现为淡红色和红色，讲明花青素含量较高。在30%氨水测试中，7个不同发育期的圆齿野鸦椿提取液表现出不同程度的黄色。盛花期50、130d出现深黄色，表明果皮中可能含有黄酮醇类化合物；盛花期后70、100、115、
11、160d呈现黄色，表明果皮中可能含有黄酮色素。2.3类黄酮的定性测试1浓盐酸-锌粉反响：盛花期后50100d出现不同程度的黄色，表明这3个时期的圆齿野鸦椿果皮可能含有黄酮，而盛花期后115180d呈现不同程度的粉色和红色，表明可能含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮或花青素类化合物，讲明果实发育经过中会产生新的黄酮类化合物。2浓盐酸-镁粉反响：盛花期后5070d出现绿色和黄色，而100180d出现不同程度的粉色和红色，讲明在100d之后可能合成了黄酮、黄酮醇、二氢黄酮或花青素类化合物。3FeCl3反响：不同发育时期的圆齿野鸦椿果实浸提液与FeCl3反响均出现深褐色，讲明7个发育时期的果皮均不含酚羟基。4
12、AlCl3反响：盛花期后50、70d出现不同程度的黄色，讲明可能含有黄酮。5氨性氯化锶反响：不同发育时期的果皮均出现沉淀，讲明含有邻二酚羟基构造的黄酮类化合物。6硼酸反响：不同发育期的果皮不同程度的绿色、粉色及红色，讲明不含C5-OH构造。7浓硫酸反响：不同发育时期的果皮浸提液均出现红褐色，可能含有花青素。8碱性试剂：盛花期后50、130d出现颜色较深的黄褐色，相比之下，其余的5个发育时期则出现颜色较浅的黄色，讲明前者可能含有的二氢黄酮或二氢黄酮醇大于后者。9硼氢化钠反响：盛花期后5070d出现绿色和黄色。100180d出现不同程度的粉色和红色，讲明100d之后可能产生了二氢黄酮。2.4果皮色
13、素成分的紫外可见光谱分析利用可见紫外分光光度计在400700nm范围内全波段扫描叶绿素和类胡萝卜素提取液，叶绿素的特征吸收峰出如今665nm附近，类胡萝卜素大约在435、470nm有吸收峰；类黄酮在500nm左右出现峰值，且无杂峰干扰，在500nm处，测定标准样品的吸光值，并以吸光值为纵坐标，质量浓度mg/mL为横坐标，绘制芦丁标准曲线。得到回归方程为：y4.9172x0.0051，R20.9991，表明芦丁质量浓度在0.01380.0828mg/mL范围内线性关系良好；花青素在520nm左右出现峰值，且无杂峰干扰。2.5果皮色素含量分析在圆齿野鸦椿果实发育经过中，叶绿素呈现先急剧下降到缓慢下
14、降的趋势。盛花期后50d叶绿素含量最高，其含量高达0.303mgg-1，在盛花期30115d叶绿素含量急剧下降，之后下降趋势减缓，并在180d到达最小，见图4A。由图4B可知，在不同的发育阶段，圆齿野鸦椿类胡萝卜素含量分布在0.0160.050mgg-1之间，含量均较低，随着果实的成熟，类胡萝卜素基本呈现不断下降的趋势。类胡萝卜素与叶绿素之间呈显著正相关R0.991表3，讲明在合成代谢经过中二者可能有良好的协同作用。在果实发育经过中，类黄酮含量出现先下降后上升再下降的S型变化趋势，见图4C。由图4C可知，类黄酮最高出如今盛花期后50d，含量高达28.378mgg-1，之后出现剧降，直到盛花期后
15、100d才又开场逐步上升，并在盛花期后130d出现第二个峰值25.326mgg-1，之后开场逐步下降至盛花期180d出现最低值20.975mgg-1。类黄酮与叶绿素和类胡萝卜素均呈显著正相关，而与花青素相关性不显著。2.6果实色泽与色素含量的关系在CMYK形式中，C、M值分别代表青色和洋红，测得圆齿野鸦椿果皮的叶绿素和类胡萝卜素含量与内外果皮的C值呈显著正相关，而与M值呈显著负相关，讲明圆齿野鸦椿从绿色变为红色，可能与叶绿素和类胡萝卜素的降解有关；类黄酮的含量很高，但却与内外果皮的CMYK值均无显著相关，讲明圆齿野鸦椿果实发育经过中，类黄酮出现了较为复杂的变化，可能会有新黄酮类物质产生同时伴随
16、某些黄酮类物质消解；花青素的含量与内外果皮的C值呈显著负相关，而与外果皮的M值、内果皮的M、Y值呈显著正相关，讲明果实由绿转红的经过中，可能与花青素的积累有关。3讨论与结论为了减少外界环境和主观因素的影响，近年来，数码技术已经开场运用在植物色彩的描绘上，如利用数码技术描绘观赏海棠的色彩14、测定板栗果实的褐变20、描绘芒果花瓣和花药的色彩21等。因而本试验利用数码测色法观测圆齿野鸦椿果实色泽的变化，结合实际内外果皮的颜色的变化绿色红绿红色，发现果皮的绿色与C、Y值关系密切，而果皮的红色是由M、Y值起决定作用的。CMKY值与色素含量相关性分析也表明，果实发育经过中逐步下降的叶绿素和类胡萝卜素含量
17、，与果皮的C值均呈显著正相关，与M值呈显著负相关，而果实发育经过中逐步升高的花青素的含量与果皮的C值呈显著负相关，而与果皮的M值显著正相关，讲明果实由绿转红的经过中，可能与叶绿素和类胡萝卜素的降解，并伴随着花青素的积累有关。相关的研究表明，果实中含有叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮花青素为类黄酮物质等多种色素，在果实发育的经过中，因各部分色素不断代谢使果实的颜色发生变化。本研究表明，圆齿野鸦椿果实逐步成熟的经过中，果皮呈现绿色红绿红色的色彩变化。随着圆齿野鸦椿果实的成熟，各色素的变化呈现一定的规律，其中叶绿素和类胡萝卜素的含量均呈逐步下降的趋势，且两者呈显著正相关，可能在合成代谢经过中二者有良好的协
18、同作用，类胡萝卜素对叶绿素分子有保护作用，详细作用机理有待进一步研究；花青素则出现逐步上升的趋势，与其它色素含量呈负相关，其中与类胡萝卜素、叶绿素负相关显著，结果与李果22、山楂23等的研究结果一致，讲明果实呈色经过中，叶绿素和类胡萝卜的含量逐步减少，伴随着花青素的增加，花青素的积累与果实逐步变红可能有密切的联络；类黄酮含量出现先下降后上升再下降的S型变化趋势，分别在盛花期后50和130d出现峰值，讲明果实发育经过中可能会产生新的黄酮类化合物，并伴随着某些类黄酮物质的消解，这在黄酮类物质显色反响中得到互相印证，类黄酮的变化与花青素的变化没有显著相关性，这与苹果24色素的研究结果一致，可能是随着果实的成熟，果实中花青素含量不断升高，光合产物流向花青素的合成途径，减缓了酚类物质的合成，进而使果实中类黄酮含量较稳定。综上所述，本试验利用传统的方法对圆齿野鸦椿果皮色素的组成及含量进行了初步定性、定量分析，但要对色素进行准确的定性及定量分析还需要利用更精准的当代技术，如利用HPLC和LC-MS等，而且本试验的试验材料采自清流，还需采集多个地方的圆齿野鸦椿果实观测其呈色变化，以便对圆齿野鸦椿果实颜色着色机制有更全面和准确的了解。