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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流焦成瑾第二稿山黧豆及其中毒马冰2.精品文档.山黧豆及其中毒马 冰甘肃省陇西县宝凤初中 748100【摘要】山黧豆是一种栽培历史悠久饲料作物，然而，由于山黧豆中毒现象的发生，现在许多地方已不再种植。为了更好的利用山黧豆，人们在毒性方面做了大量工作，主要集中在培育低毒品种和脱毒研究方面。本文从山黧豆毒素的生物化学、毒素生物合成、环境因素对毒素含量的影响等几个方面简单综述了近年来的研究进展情况。另外，对脱毒研究也进行了简单讨论。关键词：山黧豆; ODAP; 中毒症状；中毒机理毒；去毒Studies on both toxic biochemistr
2、y and Lathyrism in Lathyrus sativusAbstract: Lathyrus sativus is a feed crop with a long cultivated history. However, it s cultivation has diminished in many regions because of it s toxicity. In order to reuse this fine kind of forage crop, intensive researches for developing varieties with low and
3、zero toxin have been carried out around the world. The toxic biochemistry of Lathyrus sativus, including composition, biosynthesis and the effect of environment on biosynthesis of toxin, was reviewed in this paper. In addition, research of removal toxin from Lathyrus sativus by breeding , processing
4、 , tissue cultures and transgenesis were mmarized. Key words : Lathyrus sativus; neurotoxin (ODAP); toxic biochemistry; varieties with low-toxin; tissue cultures前言山黧豆,即家山黧豆( Lathyrus sativus) ,是豆科蝶形花亚科山黧豆属一年生草本植物1。原产北半球温带地区,亚洲、欧洲及非洲等地曾广泛种植,在欧洲,栽培历史可追朔到新石器时代2。我国曾在东北、华北及陕、甘等地大面积种植。含氨基酸达17种,与谷物类作物相比赖氨酸
5、含量很高,山黧豆抗寒、抗旱,耐贫瘠,抗病虫害及易管理是许多地区尤其是干旱和半干旱地区大量种植的主要原因,然而,长期连续食用山黧豆可导致人畜中毒。家山黧豆作为人类的食物及动物的饲料长期以来因其营养丰富具有耐旱、耐寒等优良生产性状广受世界各地的青睐特别是在大旱年份，在其它粮食作物绝收的情况下，仍有较好的收成因此被视为干旱及半干旱地区首选的优良作物，但由于其含有毒素-ODAP使山黧豆的种植受到限制2。山黧豆还有优良的农艺性状,使人们认识到重新开发的价值。鉴于此,自20世纪60年代以来,人们对山黧豆的毒性作了一系列研究,分离并鉴定出了有毒成分,对毒素的生物合成、遗传背景、环境影响作了许多研究,并对去毒
6、方法作了有益的探索。我国对山黧豆的研究起步于20世纪70年代，当时在我国甘肃省中部地区由于连年的干旱粮食匮乏，耐干旱、耐贫瘠的山黧豆是他们唯一能收获到的救命粮。然而由于当时食用过量，曾导致甘肃省许多县市的农民中毒，严重者下肢瘫痪。下面就目前山黧豆及中毒方面的有关研究进展作一简要综述。1 山黧豆毒素研究1.1有毒成分山黧豆毒素研究一直是有关山黧豆研究的一个热点。目前人们已发现山黧豆中含有4种毒素：-草酰氨基丙氨酸（-N-Oxalyl-Amino-l-alanine）,简称BOAA，也叫-N-草酰基-L-，-二氨基丙（-N-Oxalyl-L-diaminopropionic acid）,简称ODA
7、P；氰基丙氨酸（cyanoalanine）以及它的谷酰基衍生物谷酰基氰基丙氨酸（glutamylcyanoalanine）；氨基丙腈（aminopropionitrile），简称BAPN，以及谷酰基的衍生物谷酰基氨基丙腈；L，二氨基丁酸（L，diaminobutyic acid），简称DABA，以及其衍生物N草酰L，二氨基丁酸3。其中山黧豆中含有的-N一草酰一，-二氨基丙酸(ODAP)是山黧豆中毒的主要成分。1964年，Rao鉴定出山黧豆中含有的一种非蛋白质氨基酸-N-草酰基-L-，-二氨基丙酸，即ODAP，是山黧豆引起中毒的主要成分4。它在山黧豆的整个生长周期都存在，主要位于最活跃的生长部位
8、。在整个生长周期，苗期的毒性最大。在种子萌发时，ODAP浓度增加，这是净合成的结果。Rao等人试验研究表明，种子暗萌发5d后，在1618h的光暗循环中生长；2d后，ODAP的总浓度（67umol/g）比干种子（41umol/g）增加63.4，比吸涨种子（11.8umol/g）增加467.8。在生长过程中，地上部分含有较高的ODAP浓度，其中大约8的ODAP存在于叶子中，而在根中ODAP含量逐渐减少（ODAP可以从根中渗出）5 ,6。ODAP萌发中不降解，在不良环境下降解后，提供必要的氮源贮存。邢更生等试验表明，水分胁迫与山黧豆植物中ODAP的积累有关，增强水分胁迫可导致ODAP积累的增加7,8
9、。ODAP有和两种异构体，其中ODAP有毒，而ODAP是无毒的，ODAP是体内合成的，ODAP是ODAP的转化产物，在ODAP的水溶液中ODAP可重排形成ODAP9。Abegaz等人发现加热能使ODAP形成ODAP，表明重排和水解有竞争。在55，30h，ODAP的D2O溶液形成/等于60/40的平衡，ODAP在同样条件下，也能形成、混合物，因此有人用水煮加热把有毒ODAP转化为无毒的ODAP，以作饲用，但这并不能完全去除山黧豆的ODAP10。Lambein 和Kou等人报道了动物对ODAP的感受性可能与动物体内或饲料配方中缺乏微量元素Zn有关11；同时，大量研究表明：ODAP溶于水，若加10倍
10、的水，分成3次浸泡山黧豆豆粉24h，可去毒90，但其水溶性营养物也随水浸泡丢失。目前预防本病的根本措施是不可长期过量地饲喂山黧豆，更理想的途径是培育低毒、甚至无毒的山黧豆新品种。1.2 ODA P生物合成的途径探讨ODAP生物合成的途径，是应用生物化学方法阻断ODAP合成的基础。虽然ODAP生物合成的研究较多，但其中的一些环节尚未了解得很清楚。早在1964年Murti就提出L-，-二氨基丙酸(DAPA)草酰化可形成ODAP，而后者可能是由丝氨酸或天冬氨酸而来12。已经证明在山黧豆幼苗中-(isoxazoline5-on-2-yl)-L-alamine，简称BIA是ODAP合成的前体7,8。当1
11、4C标记BIA与 DAP加入时，DAP将抑制ODAP形成。而当14C与草酸一起加入时，草酸能促进14C的掺入。这证明BIA是ODAP的前体，DAP是BIA和ODAP间的中间体。BIA虽在苗期存在，但是在成熟的种子中没有发现BIA，这种情况在那些苗期含BIA但不含ODAP的豆科植物中也存在。在子叶，胚轴ODAP生物合成能力不一样，放射性掺入BIA，而ODAP无放射性，在根和芽中也无放射性，也许是在老组织中BIA贮存于液泡中，使得这个次生代谢物份J进一步代谢13。在成熟过程的植株和豆荚中都汐右检测BIA，也许成熟期B IA有另外的价谢途径困14。在BIA 和ODAP之间还有一个可能的短寿命的中间体
12、DAP15。它能通过ODAP合成酶的催化与草酞辅酶A生成ODAP, BIA酸解或者254nm光解后，可形成DAP，这是推测DAP是BIA和ODAP之间的中间体的根据之一。生物体内B工A开环的机制还不清楚，有可能象254nm光解的开环机制一样，有一分子水参与开环(图1)。虽然推测DAP是中间体，但无论是Lsatzvu的种子或萌发后都没检测到游离DAP。可能DAP能快速地形成稳定的草酞衍生物。有趣的是Malathi16的实验发现，无细胞抽提物中，即使不加DAP也有少量ODAP形成，这暗示了山黧豆中存在内源DAP前体，它可能是DAP的一个衍生物。 综上所述，ODAP的生物合成的可能途径是(图即利用放
13、射性同位素标记的方法证明ODAP的碳原子来源于BIA的丙氨酸侧链，BIA的异噁唑环的氮原子掺入ODAP中。1.3 ODAP中毒症状 人若每餐有30% 50%山黧豆种子，连续食用36个月，就会有中毒症状。生食未经处理豆子能发生急性中毒，表现为双下肢痉挛瘫痪，轻者走路无力，迈步困难，重者呈剪刀步态，卧床不起、双侧膝反射、跟腿反射亢进，小腿肌肉萎缩，呈上下神经元联合损害，类似肌萎缩侧索硬化。部分病人出现尿急、尿频，这些症状出现是以脊髓损害所致;慢性中毒还能损伤肝、肾等实质细胞17。 用大剂量高毒山黧豆长期饲喂小白鼠，也可发生急，慢性中毒，中毒症状同人相似18慢性中毒无致癌症或促发肿瘤作用，对动物繁殖
14、也无明显影响，胚胎发育无畸形表现19。有报道在具有延年益寿人参中也含(3-ODAP，大概为0.4 g/kg，有人建议参照人参摄入量食用此豆20。1.4 ODAP中毒机理研究认为，非蛋白质氨基酸ODAP在动物体内为谷氨酸的类似物而作为神经递质信号分子。人体神经细胞在远距离传输电脉冲过程中，要使神经信号通过神经元之间间质，神经元末端就会产生一种化学物质充当递质，谷氨酸就是此类物质。当递质与目标神经细胞上受体结合后，将刺激神经元产生自己相应电脉冲，使刺激信号快速穿过大脑和神经系统。AMAP则是此类受体中一种，Spencer指出21，ODAP过分刺激AMAP受体，使神经细胞耗竭而最终死亡，控制腿部运动
15、则是那些最脆弱神经元，这就可解释中毒者奇怪剪刀步态22。又有研究认为，对AMAP受体不断刺激，使细胞产生大量NO，对人体起过氧化作用，但人体自身抗氧化系统，如过氧化物歧化酶、谷胧甘肤过氧化物酶等都需要一定金属离子作为辅基，而营养不良、体内缺乏微量元素加剧NO的氧化作用，也就使机体对毒素更敏感。Rao通过实验指己，对于体内缺乏Zn的人食用此豆时更容易引起中毒2EN-neking建议应在中毒人群中研究一下营养不良与中毒关系23Getahun在中毒流行埃塞俄比亚调查研究中发现，在食用此豆时加入辣椒或其它一些物质，可减轻中毒症状23。由于豚鼠比其它实验动物对神经毒素更敏感，有科学家建议用它作为此毒素动
16、物模型24。2山黧豆的去毒研究2.1 -ODAP的遗传和低毒品种的选育发现山黧豆神经中毒主要由-ODAP引起之后，人们自然要探究控制-ODAP的遗传背景，以便用杂交和生物技术方法选育低毒或无毒品系。研究表明，-ODAP的含量在同一品种中和不同品种问变异很大，用低毒L720060品系作为母本其后代毒性比用作父本的低，而L S82046品系则相反，故人们推测-ODAP的含量可能还受细胞质因了的影响25。Pandey等对4对高毒和低毒品种杂交结果分析表明-ODAP的含量既有基因相加效应(数量遗传)又有非相加效应(显隐性遗传)，从F2代中-ODAP含量的分布频率可以看出-ODAP合成受多基因控制26。
17、另外，人们对用于杂交的雄性不育植株研究发现，不育植株中可能存在单个或成对的育性恢复基因，即不育性并不稳定25。尽管如此，人们通过大量的杂交及筛选，也获得了一些低毒品系，但由于稳定性差均未能应用推广25 ,27。鉴于此，ChtourouGho-rbel等用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymor-phism ,RFLP)和随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA ,RAPD)标记技术对9个不同地域的品种和5个具有代表性的山黧豆品种进行了DNA分了变异性分析(analysis of molecular
18、 variance ,AMOVA)，并建立了RAPD片段库28 ,29，为今后分了生物学方法改造山黧豆提供了参考。 为了获得低毒山黧豆品种，人们也尝试了理化因了诱变技术，发现在山黧豆诱变方面，化学诱变剂如甲基磺酸乙酷(ethyl methane suphonate,EMS)和N一亚硝基一N一甲脲(N-nitroso-N-methylurea ,NMU)比高能射线更为有效28，但王崇英等30覃新程等31分别用C6+重离了处理山黧豆种了，发现高能射线能产生更宽的形态突变谱，不过均未通过诱变获得可以推广应用的低毒或无毒山黧豆品种。2.2山黧豆的组织培养及遗传转化 基因工程作为现代生物技术的核心，在改
19、造作物方面比传统的遗传育种和诱变育种更为有效，随着这一技术的日趋成熟，人们已经获得了大量的优良转基因作物和草种。组织培养再生体系的建立是进行基因工程操作的前提。Gharyal等对8个山黧豆品种进行组织培养，发现直接培养时，顶端分生组织的愈伤化程度很低，而且品种问差异比较大，打顶后，打破休眠的腋芽分生组织则极易形成愈伤组织，几乎没有种间差异，芽分化率很高，叶片愈伤组织的诱导及芽的分化频率也比较高，他们还从这些愈伤组织中观察到了大量的最终能发育出正常植株的胚状体32。而Malik等将山黧豆种了放在含有6-节基氨基嘌呤(BAP)的MS培养基中萌发，取下胚轴作为外植体，可直接产生大量的芽而不经过愈伤化
20、33随后他们进一步发现这种在BAP存在下萌发的幼苗可整株作为外植体诱导大量芽的形成34。2002年，Zambre等人报道了他们获得可育再生植株的新方法，以高毒和低毒山黧豆品种的顶芽和侧芽作为外植体，在含有NAA或IAA结合苯基二唑脲(thidiazuron , TDZ)的B5基本培养基上诱导产生了绿色愈伤组织，这种绿色愈伤组织在以后的传代中不但可产生大量的再生芽，而且均可发育为可育的再生植株35。 在山黧豆组织培养得到的再生植株中，有时还能发现一些有价值的低毒(0.015 %)无性变异系36，Mehta等发现这些低毒变异系单产还比较高，有些还伴有一系列其它方面的变异，如花期缩短、叶了及茎节问变
21、长等37。这些低毒无性变异株无疑是进一步培育稳定遗传的低毒品种极有价值的材料。也正在试图通过激素成分、大量元素和微量元素的调整与组合建立高效的山黧豆再生体系，以便为其遗传转化和无毒或低毒品系的培育奠定基础。 通过分了生物学方法获得低毒或无毒山薰豆品系的研究始于20世纪90年代初。Sukanya等首先从土壤中分离到可以降解-ODAP的菌株B YA I，并将其质粒中可降解-ODAP的基因片段构建到载体PUCIS中38，后来Praveen等也分离出以-ODAP为唯一碳源和氮源的另一菌株B Y KI，并做了与Sukanya等相似的研究39。但到目前为止尚未见植株转化的报道。2. 3种子的加工去毒 在食
22、用前对种了进行适当处理也能去掉大部分毒性。由于-ODAP是水溶性的，我国研究人员早就建议用水浸泡可去掉一部分毒性(26 %)，若将其种了加工成粉条可去掉99%以上的毒性40。另外，蒸、煮、烤等均能不同程度(39 % -82 %)地降低毒性41，最近，Rao等人对煮熟的豆了通过分别接种米曲霉(Aspergillus oryzae)和小抱根霉中华变种(Rhizopus microsporus var chinesis)在30 0C下进行2次发酵后，高毒和低毒种了中-ODAP的去除率分别达到了94. 8%和82. 2 %。而且种了的营养成分大为改善。一些人体必需的氨基酸如谷氨酸、组氨酸、苏氨酸及赖氨
23、酸，尤其含硫氨基酸的含量明显增高42综上所述，尽管人们尝试了许多方法，但目前还未得到完全无毒的山黧豆品系，然而，许多动物饲养试验表明43，低毒山黧豆对动物是安全的，尤其将低毒山黧豆与普通饲料搭配饲喂，对禽畜不会造成生长抑制或毒害。当用含低毒山黧豆坦-ODAP平均为0. 13 %) 82%的混合饲料喂养7d龄小鸡4周后，小鸡未出现任何中毒症状。对猪的饲喂结果表明，饲料中低毒山黧豆-ODAP0.09 %)占到30%也是安全的。而绵羊由于其瘤胃对R-O-DAP的分解作用，将低毒山黧豆的比例增至70%也安然无恙。这些结果提示，将低毒山黧豆按适当比例与其它牧草混合种植，不但可肥沃土壤，改善牧草品质，对放
24、牧也是有益而无害的。3展望自从鉴定出-ODAP 为致毒因素以来 ,人们围绕-ODAP 在植株中的产生以及去毒进行了大量的研究 ,取得了不少成果 ,但一些关键性的问题仍未完全解决。去毒方面的深入研究必将促进它在植被恢复 ,丰富草地种质资源 ,防止草地退化等方面的广泛应用。为了使山黧豆这一营养价值高、口感好和适应性强的豆类草种能够得到大面积的推广种植 ,科研工作者还需打破学科界限 ,加强合作 ,更新思维模式 ,付出艰苦不懈的努力 ,相信山黧豆应用的前景是广阔的。今后山黧豆研究工作的重点应该放在以下几个方面:1) 建立高效的山黧豆组织培养再生体系 ,为其遗传转化奠定基础; 2) 克隆-ODAP 合成
25、途径中 3 种重要酶的基因 ,通过反义技术 ,筛选无毒和低毒品系;3) 加强-ODAP 代谢途径的研究 ,寻找降解其在植株内积累的因素;4) 揭示环境因素尤其是矿质营养对植株-ODAP 合成的影响 ,筛选降低-ODAP 合成的因子并进行田间试验 ,使山黧豆毒素的合成与积累降低到最低程度;5) 重视人畜对山黧豆营养不平衡吸收与中毒机理关系的研究 ,寻找与山黧豆合理搭配的食品与饲料 ,使人畜食用后不致中毒;6) 探明-ODAP 合成与积累的真正生物学意义 ,以便有针对性的进行去毒研究。四参考文献：1中国科学院中国植物志编辑委员会.山黧豆属（Ml.中国植物志（42卷).1998.42(2) :27o
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