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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究.精品文档.斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究摘要: 体外检测了 3 株斜带石斑鱼( Epinephelus coioids) 肠道乳酸菌的产乳酸能力、抑菌活性、对高温、低 pH 值、高胆盐、人工胃液及人工肠液的耐受能力等，为海水鱼益生菌的开发提供理论依据16S rNA 基因测序分析表明，LS61、LS64、LS77 菌株分别为植物乳杆菌( Lactobacillus plantarum) 、肠膜明串珠菌( Leuconostoc mesenteroides) 、糊精乳杆菌( Lactobacillu
2、s dextrinicus) 3 株菌摇瓶培养40 h 后发酵液中乳酸含量分别达到 55. 6、51. 6、58. 3 mmol / dm3且发酵上清液对致病菌有较强的拮抗活性 耐受性实验结果表明，pH 值为 3. 5、4. 5 的 MS 培养基对这 3 株菌存活影响较小; pH 值为2. 5 的 MS 培养基对 LS64、LS77 的影响较大，而对 LS61 菌株的存活基本没有影响 这 3 株菌对不同 pH 值的人工胃液的耐受性与之相似，说明 LS61 菌株的 pH 值耐受性最好，其次是 LS64 菌株，LS77 菌株最差 3 株菌对高胆盐也有不同的耐受性，含 1和 2胆盐的 MS 培养基对
3、 3 株菌的影响较小，而在3的胆盐处理4. 5 h 后，LS64 菌株的存活率仍保持在30. 7%，LS61 菌株的存活率为2 0% 左右，LS77 菌株的存活率接近 1 0% 在 4的胆盐含量下，LS61、LS64 菌株的存活率仍高于1 同样，不同胆盐含量的人工肠液对这 3 株菌的影响与之相似 乳酸菌 LS61、LS64 菌株具有较强的产乳酸和抑菌能力，具有一定的 pH 值耐受性和较高的胆盐耐受性，可考虑作为潜在的益生菌株应用于水产健康养殖关键词: 海洋生物学; 斜带石斑鱼; 乳酸菌; 抑菌活性; pH 值; 胆盐; 益生菌随着石斑鱼养殖的兴起和高速发展，在带来巨大经济效益的同时也出现了一些
4、问题 石斑鱼细菌性疾病和寄生虫病害严重，抗生素等药物的频繁使用导致致病菌耐药性的增强，解决这些问题就需要探寻一种绿色的养殖模式，需要一种高效生态的方法来控制细菌性病害 因此，许多科学家都期望利用微生物之间的拮抗作用预防和治疗石斑鱼细菌性疾病1-3乳酸菌作为益生菌已被广泛应用于人体的保健医疗、健康和食品等多个方向 如 Youn 等( 2012) 用流感病毒感染 BALB/c 小白鼠，发现活的乳酸菌对增强免疫有显著效果，提高了小白鼠的存活率4Matsumoto 等( 2006 ) 研究证实含乳酸菌的牛奶对稳定人体肠道环境和微生物菌群具有积极作用5 Burns 等( 2012) 从奶酪中分离得到 2
5、 株乳酸菌，将其用于发酵奶酪，与不加乳酸菌的对照组进行氨基酸含量、食品风味等进行比较，发现添加乳酸菌发酵的奶酪中氨基酸含量和风味明显好于对照组6 乳酸菌在畜禽养殖上的应用也取得了较大进展，如 Zhang 等( 2012) 发现罗伊乳酸杆菌( Lactobacillus reuteri) 能提高患白痢雏鸡的存活率7 此外，乳酸菌在水产养殖上的应用也取得了一定成果，如刘倩等( 2006) 阐述了乳酸菌对提高鱼类抗病力、生长速度和存活率的重要作用8Lara-Flores 等( 2003 ) 发现将粪链球菌 ( Streptococ-cus faecium) 和嗜酸乳杆菌 ( Lactobacillu
6、s acidophi-lus) 添加到饲料中投喂可以促进尼罗罗非鱼( Ore-ochromis niloticus) 鱼苗的生长，提高饲料利用率等9; Suzer 等( 2008) 研究发现，乳杆菌投喂处理等显著提高金头雕( Sparus aurata) 幼体的存活率、4 期 陈艳武，等: 斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究 531特定生长率和肠道酶活10尽管乳酸菌在水产养殖上应用的报道不少，但是，由于缺乏真正适合水产动物的益生菌株，目前许多水产上使用的益生菌分离自环境或者陆生动物，这些益生菌往往因为无法在水产动物消化道存活而不能发挥益生效果，因而限制了它们在水产养殖上的应用 理想的益生菌
7、应该来自动物自身胃肠道11-13 此外，所选用的益生菌还必须能够耐胃肠内强酸、高胆盐的环境，才能够在消化道内大量存活、定植，发挥益生作用14-15本文通过分离斜带石斑鱼( Epinephelus coioids)肠道的乳酸菌，对其部分生物学特性，包括产乳酸的能力、抑制病原指示菌的能力，以及耐受低 pH 值和高浓度胆盐的能力等进行了研究，初步评价乳酸菌作为益生菌应用于石斑鱼养殖的可能性1 材料与方法1. 1 菌株的分离与鉴定1 1. 1 乳酸菌的分离纯化 实验所用的斜带石斑鱼购自厦门市大学路菜市场 取健康活泼的斜带石斑鱼 4 尾，用 75% ( V/V) 酒精棉球擦拭鱼体表面，在紫外灭菌后的超净
8、工作台中解剖胃肠道，取消化道内容物和消化道粘膜用无菌生理盐水制备成匀浆液，将匀浆液 10 倍梯度稀释至 10 4 取原液和各个梯度稀释液各100 mm3分别涂布 MS 平板，每个梯度设 3 个重复，平板置于 28恒温培养5 d 挑取各种类型单菌落接种至 MS 平板上，多次划线传代，直至镜检确认纯种 对单菌进行接触酶实验，选取接触酶阴性的菌株进行 16S rNA 测序鉴定1 1. 2 乳酸菌的鉴定 利用细菌基因组 DNA 提取试剂盒( 上海赛百盛基因技术有限公司) 提取细菌基因组 DNA 以细菌通用引物 27f ( 5-AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG-3) 和 1492r (
9、 5-ACG GCTACC TTG TTA CGA CT-3) 扩增细菌 16S rNA 基因片段 PC 反应条件:94 4 min;94 40 s，55 40 s，72 1. 5 min，35 个循环; 72 10 min 用 1. 0% 的琼脂糖凝胶电泳检测 16S rNA 基因扩增产物，扩增产物送上海英骏( Invitrogen) 生物技术有限公司进行纯化和测序，序列于 GenBank 网站上进行 BLAST比对分析1 1. 3 病原指示菌 抑菌试验所用的指示菌哈维氏弧菌( Vibrio harveyi) QBY3 为本实验室分离自患病斜带石斑鱼眼球部位，坎贝氏弧菌( Vibrio ca
10、mp-bellii) VH1 为本实验室分离自患发光病南美白对虾( Litopenaeus vannamei) 体内16，嗜水气单胞菌( Aeromonas hydrophila) SHI 为山东大学杜宗军老师惠赠，实验证实 3 株菌对南美白对虾和斜带石斑鱼均具有中等强度的致病性 指示菌均用 216L培养基培养1. 2 乳酸菌产酸能力的测定将用液体 MS 培养基活化好的乳酸菌以 5%( V/V) 的接种量接入新鲜的 MS 培养基中，摇瓶培养，每隔4 h 取样测 pH 值和乳酸含量 乳酸含量采用南京建成生物工程研究所的乳酸测定试剂盒进行测定1. 3 发酵上清液抑菌实验采用琼脂板打孔法进行抑菌实验
11、 发酵上清液的制备: 将用液体培养基活化好的乳酸菌以5 % 的接种量接入新鲜的 MS 培养基中，摇瓶培养 48 h，4 条件下 6 300 r/min 离心 20 min，取上清用 0. 22 m 滤器过滤后进行抑菌试验 分别用乳酸调 MS 液体培养基至与 3 株菌培养发酵上清液相同的 pH 值，作为对照进行抑菌试验 分别测定乳酸菌 48 h 发酵上清液和对照液的抑菌圈直径1. 4 温度对菌株存活的影响在 MS 培养基中接入已活化好的菌种，初始浓度保持在 106数量级，然后于 28、40、60、80 处理0、0. 5、1. 5、3. 0、4. 5 h，取样涂板计数，每个处理 3个重复1. 5
12、pH 值对菌株存活的影响试验设置了 4 个 pH 梯度处理: 1. 5、2. 5、3. 5、4. 5 分别用 1 mol / dm3的 HCl 调节 MS 液体培养基至上述 pH 值 把用液体 MS 培养基活化好的LS61、LS64、LS77 菌株以 5% 的接种量分别接种至上述各 pH 梯度处理，28静置培养 在接种初始及接种后 0. 5、1. 5、3. 0、4. 5 h 取样涂板计数，每个处理 3 个重复1. 6 胆盐含量对菌株存活的影响试验设置了 1、2、3、4( m/m) 共 4 个胆盐含量梯度处理组，分别用胆盐调节 MS 液体培养基至上述浓度 把用液体 MS 培养基活化好的 LS61
13、、LS64、LS77 菌株以 5% 的接种量分别接种上述各处理，28静置培养 在接种初始及接种后0. 5、1. 5、3. 0、4. 5 h 取样涂板计数，每个处理 3 个重复1. 7 菌株在人工胃液和人工肠液中的存活人工胃液和人工肠液的配制参照文献17的方法，人工胃液中含有 1%( m/m) 的胃蛋白酶，人工532 应 用 海 洋 学 学 报 32 卷肠液中含有 1%( m/m) 的胰蛋白酶 把用液体 MS培养基活化好的菌种以 5% 的接种量分别接种于上述 pH 值为 2. 5、3. 5、4. 5 的人工胃液中，28 静置培养，接种初始及接种后 1. 5 h 取样稀释涂板计数把用液体 MS 培
14、养基活化好的菌种以 5% 的接种量分别接种于上述胆盐浓度值为 1、2、3、4的人工肠液中，28 静置培养，接种初始及接种后3. 0 h 取样稀释涂板计数，计算存活率1. 8 数据处理文中 pH 值、乳酸含量、抑菌圈直径和活菌数量均为 3 个重复的平均值，数据用统计软件 SPSS19. 0单因子多重比较中的 Duncan 进行统计学方差分析，以平均值 标准差表示2 结果与分析2. 1 3 株乳酸菌的 16S rNA 鉴定结果如表1 所示，根据菌株的16S rNA 基因测序分析结果，LS61 鉴定为植物乳杆菌( Lactobacillus plan-tarum) ，LS64 鉴定为肠膜明串珠菌(
15、Leuconostoc mes-enteroides) ，LS77 鉴定为糊精乳杆菌 ( Lactobacillusdextrinicus) 2. 2 乳酸菌发酵液的抑菌活性在培养 48 h 的条件下，这 3 株乳酸菌发酵液对病原指示菌的抑制结果如表 2 所示由表 2 可知，这 3 株乳酸菌发酵液对哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌和嗜水气单胞菌均有较强的抑制效果，抑菌圈直径都在 15 mm 以上 而对照组( 用乳酸调 MS 培养基 pH 值至与培养发酵液相同) 对这 3指示菌也有一定的抑制作用，但明显弱于乳酸菌发酵液对其的抑制作用，差异显著( p 0. 05) 推测这3 株乳酸菌的抑菌作用一方面是由于低
16、 pH 的作用，另一方面是由于乳酸菌本身产生除乳酸以外的其他抑菌物质表 1 3 株乳酸菌菌种鉴定结果Tab 1 Identification of lactic acid bacteria菌株 最近源模式种 相似度/% NCBI 登录号LS61 Lactobacillus plantarum ATCC 14917( T) 100. 0 KC700038LS64 Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293( T) 99. 9 KC700039LS77 Lactobacillus dextrinicus JCM 5887( T) 99. 9 KC700040表 2 乳酸
17、菌发酵液对 3 种病原指示菌的抑制效果比较Tab 2 Inhibition effects of lactic acid bacteria against 3 pathogenic indicator bacteria乳酸菌抑菌圈直径/mm哈维氏弧菌 QBY3 坎贝氏弧菌 VH1 嗜水气单胞菌 SHILS61 菌株( pH = 4. 2) 18. 5 0. 2a18. 1 0. 2a20. 2 0. 4a对照( pH =4. 2) 11. 6 0. 2b12. 0 0. 3b12. 5 0. 2bLS64 菌株( pH = 4. 4) 19. 0 0. 3a18. 3 0. 5a20. 0 0
18、. 3a对照( pH =4. 4) 11. 5 0. 2b12. 0 0. 4b12. 3 0. 4bLS77 菌株( pH = 4. 8) 18. 2 0. 3a18. 9 0. 6a22. 2 0. 5a对照( pH =4. 8) 11. 3 0. 2b11. 8 0. 2b12. 0 0. 3b注: 用乳酸调 MS 培养基 pH 值至与菌株发酵液相同作为对照组 上标注明了数据的统计学方差分析结果，同列上标字母相同者表示不存在显著性差异，同列上标字母不同者表示差异显著( p 0. 05)2. 3 乳酸菌的产酸能力对乳酸菌发酵液进行连续监测，每 4 h 测一次菌体浓度、pH 值和乳酸含量，连
19、续监测48 h 其结果表明: 这 3 株乳酸菌都在培养 20 h 左右达到稳定期( 图 1a) ，培养液的 pH 值随着培养时间的延长呈下降趋势，LS64 在 20 h 时左右达到最低点，LS61、LS77 分别在 24 h 和 32 h 左右达到最低点，其中LS61、LS64 菌株发酵液的 pH 值最终稳定在 4. 5 左右( 图 1c) 由图 1b 可见，LS61、LS77 菌株发酵液的 L-乳酸含量随着培养时间的延长而呈上升趋势，分别在 40 h 和 32 h 左右达到最高值( 分别为55. 6、61. 0 mmol / dm3) ，LS64 菌株发酵液的 D-乳酸含量在 40 h 时达
20、到最高( 51. 6 mmol/dm3) 通过对图 1b、c 的比较可以发现，这 3 株乳酸菌发酵4 期 陈艳武，等: 斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究 533图 1 不同培养时间发酵液菌体含量、乳酸含量、pH 值的变化Fig 1 Change in the cell concentration in fermentationliquid( a) and lactic acid concentration( b) and pHvalues during different fermentation periods液 pH 值的降低和乳酸含量的升高表现出了较好的协同性，可能是由于菌株产乳酸
21、才导致发酵液 pH值的降低2. 4 温度对菌株存活的影响LS61、LS64、LS77 这 3 株乳酸菌发酵液经过不同温度处理后，活菌数量的统计结果显示，3 株乳酸菌的存活量随着处理温度的升高而下降( 表 3) 在28、40 的温度下都能存活，且处理时间 0. 5、1. 5、3. 0、4. 5 h 对其存活无明显影响 但 3 株菌对较高的温度敏感，在 60、80 条件下基本无法存活，仅有LS77 菌株在 60 下处理 0. 5 h 后仍有 0. 43% 的存活率2. 5 pH 值对 LS61、LS64、LS77 菌株存活的影响pH 值对乳酸菌菌株存活的影响实验结果表明，在 pH 值为1. 5 的
22、培养条件下，3 株乳酸菌都无法存活 pH 值为 2. 5 时，LS61 菌株的存活没有受到显著影响，并且随着处理时间的延长，LS61 菌株能维持初始菌量并略有上升; LS64 菌株在处理 30min 时的存活率约为 36% ，但处理 1. 5 h 时的存活率还不到 5，随着处理时间延长至 3. 0 h，其存活率降至 0; LS77 菌株对 pH 值 2. 5 的耐受性最差，处理 30 min 时的存活率为 0 在 pH 值为 3. 5、4. 5的培养条件下，LS61、LS64 菌株均能正常生长繁殖，且菌量随处理时间延长而上升; 而 LS77 菌株存活量随着处理时间延长略有下降，在 pH 值为3
23、. 5、4. 5 培养条件下处理 4. 5 h 后的存活率分别为 43% 、70% 可见 LS61 菌株的 pH 耐受性最强，其次是 LS64，而 LS77 菌株对 pH 的耐受性最差( 表 4) 表 3 不同温度处理对乳酸菌存活量的影响Tab 3 Survival of lactic acid bacteria under different temperature菌株 处理时间/h乳酸菌存活量/cfucm 328 40 60 80LS61 0 4. 5 1064. 5 1064. 5 1064. 5 1060. 5 5. 2 1064. 7 1060 01. 5 9. 5 1066. 3
24、1060 03. 0 2. 3 1079. 2 1060 04. 5 5. 5 1072. 3 1070 0LS64 0 5. 2 1065. 2 1065. 2 1065. 2 1060. 5 8. 2 1065. 4 1060 01. 5 2. 5 1076. 7 1060 03. 0 1. 4 1086. 5 1060 04. 5 4. 2 1085. 8 1060 0534 应 用 海 洋 学 学 报 32 卷续表 3菌株 处理时间/h乳酸菌存活量/cfucm 328 40 60 80LS77 0 2. 3 1062. 3 1062. 3 1062. 3 1060. 5 1. 1 10
25、61. 1 1061. 0 10401. 5 1. 2 1061. 0 1062. 2 10203. 0 1. 4 1064. 5 1060 04. 5 1. 7 1067. 5 1060 0注: 0 h 测的菌数为初始活菌数表 4 不同 pH 值处理下乳酸菌的存活量Tab 4 Survival of lactic acid bacteria under different pH values treatment菌株 处理时间/h乳酸菌存活量/cfucm 31. 5 2. 5 3. 5 4. 5 7( 对照)LS61 0 4. 2 1064. 2 1064. 2 1064. 2 1064. 2
26、 1060. 5 0 3. 7 1063. 2 1068. 2 1065. 2 1061. 5 0 4. 3 1063. 8 1069. 7 1069. 5 1063. 0 0 4. 5 1064. 7 1061. 1 1072. 3 1074. 5 0 5. 3 1068. 9 1062. 1 1075. 5 107LS64 0 5. 2 1065. 2 1065. 2 1065. 2 1065. 2 1060. 5 0 1. 9 1065. 5 1067. 6 1068. 2 1061. 5 0 2. 2 1046. 2 1068. 9 1062. 5 1073. 0 0 0 7. 8 1
27、061. 1 1071. 4 1084. 5 0 0 9. 8 1063. 6 1074. 2 108LS77 0 2. 3 1062. 3 1062. 3 1062. 3 1062. 3 1060. 5 0 0 1. 3 1061. 8 1062. 5 1061. 5 0 0 1. 2 1061. 7 1062. 4 1063. 0 0 0 1. 1 1061. 7 1063. 4 1064. 5 0 0 1. 0 1061. 6 1063. 7 106注: 0 h 测的菌数为初始活菌数2. 6 胆盐含量对菌株存活量的影响以胆盐含量分别为 1、2、3、4的 MS液体培养基处理 LS61、LS
28、64、LS77 菌株，28 条件下处理 0、0 5、1 5、3 0、4 5 h 后乳酸菌的存活量列于表 5表 5 不同胆盐含量下乳酸菌的存活量Tab 5 Survival of lactic acid bacteria under different bile salt concentration菌株 处理时间/h乳酸菌存活量/cfucm 31 2 3 4 0( 对照)LS61 0 4. 9 1064. 9 1064. 9 1064. 9 1064. 9 1060. 5 5. 1 1064. 9 1064. 5 1045. 1 1035. 2 1061. 5 5. 5 1064. 9 1064
29、. 1 1045. 2 1039. 5 1063. 0 8. 0 1065. 3 1064. 2 1045. 4 1032. 3 1074. 5 1. 8 1078. 0 1069. 6 1047. 4 1035. 5 107LS64 0 5. 2 1065. 2 1065. 2 1065. 2 1065. 2 1060. 5 6. 4 1065. 2 1069. 4 1059. 2 1038. 2 1061. 5 1. 3 1076. 9 1061. 2 1068. 7 1032. 5 1073. 0 2. 9 1078. 7 1061. 5 1068. 5 1031. 4 1084. 5
30、4. 5 1072. 2 1071. 6 1067. 5 1034. 2 1084 期 陈艳武，等: 斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究 535续表 5菌株 处理时间/h乳酸菌存活量/cfucm 31 2 3 4 0( 对照)LS77 0 2. 3 1062. 3 1062. 3 1062. 3 1062. 3 1060. 5 1. 3 1061. 6 1062. 6 1040 1. 1 1061. 5 1. 3 1061. 3 1063. 0 1040 1. 2 1063. 0 1. 1 1060. 8 1061. 9 1040 1. 4 1064. 5 1. 0 1060. 9 106
31、1. 8 1040 1. 7 106注: 0 h 测的数量为初始活菌数在胆盐含量为 1下，LS61、LS64 菌株能生长繁殖，但繁殖速度不及对照组; LS77 菌株随着处理时间的延长，存活率呈逐渐下降的趋势，处理 4. 5 h后存活率为 44 0% 在 2的胆盐含量下，LS61、LS64 菌株仍能生长繁殖，但繁殖速度不及对照组和1的胆盐含量组; LS77 菌株随着处理时间的延长，存活率呈逐渐下降的趋势，处理 4. 5 h 后存活率为40 0% 在 3的胆盐含量下处理 4. 5 h 后，LS61 菌株仅有 2 0% 左右的存活率，LS64 菌株仍能保持22. 2% 的存活率，LS77 菌株的存活
32、率约为 1 0% 在4的胆盐含量下，LS61、LS64 菌株的存活率都很低( 仅有 1 2) ; LS77 菌株没有检测到活菌的存在 因此，LS64 菌株有较好的胆盐耐受性，能耐受3的胆盐含量，其次为 LS61 菌株，而 LS77 菌株的胆盐耐受性最差2. 7 人工胃液和人工肠液对菌株存活的影响由表 6 可知，pH 值为 4. 5、3. 5 的人工胃液对LS61、LS64、LS77 这 3 株菌生长的影响较小，处理1. 5 h 后存活率均在 16. 1% 以上，存活量均在 1 0 107cfu / cm3以上 pH 值为2. 5 的人工胃液对这3 株菌的影响不同，处理 1. 5 h 后 LS6
33、1、LS64、LS77 菌株的存活率分别为 22. 9%、0. 4%、0，存活量分别为8. 27 107、9. 17 105、6. 57 103cfu / cm3 pH 值为1. 5 的人工胃液对这 3 株菌的影响较大，处理 1. 5 hLS61、LS64、LS77 菌株的存活量在 1. 0 104cfu / cm3以下这 3 株乳酸菌受含 1、2胆盐的人工肠液的影响较小，经胆盐含量为 3的人工肠液处理 3 h后，其存活量有所下降，LS61、LS64、LS77 菌株的存活率分别为 13. 2%、84. 4%、2. 7% 经胆盐含量为4的人工肠液处理 3 h 后，存活量明显下降，LS77菌株的活
34、菌量在 1 0 103cfu / cm3以下，但 LS61、LS64 菌株的存活率仍有 0. 2% ，活菌量仍维持在1. 0 105cfu / cm3以上 综上可见，LS64 菌株对高胆盐人工肠液的耐受性优于 LS61 菌株，LS77 菌株耐受性最差表 6 人工胃液和人工肠液对乳酸菌存活量与存活率的影响Tab 6 Survival of lactic acid bacteria under artificial gastric juice and artificial intestinal juice菌株初始活菌量/ cfucm 3人工胃液( 处理 1 5 h) 人工肠液( 处理 3 h)pH
35、 存活量 / cfucm 3存活率/% 胆盐含量/% 存活量/cfucm 3存活率/%LS61 3. 61 1081. 5 8. 17 1030 0. 1% 5. 52 108152. 92. 5 8. 27 10722. 9 0. 2% 3. 68 108101. 93. 5 1. 22 10833. 8 0. 3% 4. 75 10713. 24. 5 2. 73 10875. 6 0. 4% 6. 11 1050. 2LS64 2. 56 1081. 5 4. 25 1030 0. 1% 4. 37 108170. 72. 5 9. 17 1050. 4 0. 2% 3. 79 1081
36、48. 03. 5 4. 11 10716. 1 0. 3% 2. 16 10884. 44. 5 2. 25 10887. 9 0. 4% 4. 23 1050. 2LS77 2. 42 1081. 5 3. 12 1020 0. 1% 1. 91 10878. 92. 5 6. 57 1030 0. 2% 1. 45 10859. 93. 5 7. 60 10731. 4 0. 3% 6. 53 1062. 74. 5 1. 06 10843. 8 0. 4% 2. 16 1020536 应 用 海 洋 学 学 报 32 卷3 讨论3. 1 乳酸菌产酸和抵抗病原菌能力乳酸菌通过产生各种抑菌
37、物质来抑制病原微生物的生长，常见的有细菌素18-19、乳酸、乙酸20、过氧化氢21等，其中乳酸是最常见的抑菌物质之一在肠道中，乳酸菌的生长繁殖会产生大量的乳酸，降低肠道 pH 值，从而抑制病原菌的生长繁殖20 杨红玲等( 2008) 测定了 2 株鱼源乳酸菌产乳酸的能力，EA-1、Y4-2 菌株培养 120 h 后乳酸产量分别为16、12 mmol / dm313 吴惠芬等( 2005) 研究了 5 株猪源乳酸菌产乳酸和抑菌的情况，48 h 后其中 3 株乳酸菌的乳酸产量在 10 mmol/dm3左右，1 株产量在30 mmol / dm3左右，芽孢乳杆菌( Sporolactobacillu
38、ssp ) L5 的产量高达 74. 15 mmol / dm3，这5 株乳酸菌对大肠杆菌( Escherichia coli) 和金黄色葡萄球菌( Staphyloccocus aureus) 有较好的抑制效果22 本研究中的 3 株乳酸菌对致病性哈维氏弧菌( Vibrio har-veyi) 、坎贝氏弧菌 ( V campbellii) 和嗜水气单胞菌( Aeromonas hydrophila) 均有较强的抑制作用 发酵液中的乳酸含量测定结果表明，这 3 株乳酸菌均具有较强的产乳酸能力，发酵 40 h 后乳酸产量可以达到50 mmol/dm3上，同时发酵液 pH 值降到4. 5 左右乳酸
39、菌对病原指示菌的抑制作用一方面是通过产生较高浓度的乳酸，降低发酵上清液 pH 值达到的 吴惠芬等( 2005) 报道，5 株猪源乳酸菌的抑菌活性，排除酸的影响后仍有 22% 53% 抑菌效果，经热处理后保持有 92%以上的抑菌效果，蛋白酶处理后保持85%以上的抑菌效果22 本实验中的这 3 株乳酸菌的抑菌能力显著高于对照组，各菌株发酵上清液的抑菌圈直径比对照组高 33. 7% 45. 9% 因此，可推测 LS61、LS64、LS77 这3 株菌可能产生了其他一些抑菌活性物质 对于这 3 株乳酸菌是否产生了细菌素、乙酸、过氧化氢等活性物质，如果有产生活性物质，其活性物质的结构、性质都还有待今后进
40、一步研究3. 2 乳酸菌对 pH 值、胆盐和高温的耐受能力益生菌通常以拌料方式投喂鱼，益生菌在进入鱼肠道之前，要先耐受胃内低酸和胃蛋白酶环境 一般认为，海水鱼胃液 pH 值在 2. 5 3. 5 左右，最低可达 1. 523 这就要求乳酸菌对低 pH 值环境要有较强的耐受性 赵瑞香等( 2002) 对 2 株嗜酸乳杆菌( Lactobacillus acidipiscis) 的研究表明，在 pH 值为3. 5、4. 5 处理时其存活数不仅没有下降，而且有明显上升，但在 pH 值为 2. 5 条件下 2 株菌的存活率仅为 10. 48% 和 12. 23%24 孙云章等( 2010) 通过模拟胃
41、液测试乳酸乳球菌( Lactococcus lactis) 和屎肠球菌( Enterococcus faecium) 对酸性环境的耐受能力，结果表明 pH 值为 4. 0、3. 0 的人工胃液对这 2 株乳酸菌存活的影响较小，而 pH 值为 2. 0 的人工胃液对这 2 株乳酸菌存活的影响较大，处理 4 h 后存活率小于 0. 003%17 曾小群等( 2009) 研究了 1 株能高效降解胆固醇的发酵乳杆菌对酸性环境的耐受性，结果发现该菌株在 pH 值为 3 的培养基中培养2 h 即 进 入 稳 定 期，耐 受 性 较 好25 艾 连 中 等( 2005) 研究表明，pH 值高于 2. 5 的人工胃液对植物乳杆菌( Lactobacillus plantarum) 和干酪乳杆菌( Lactobacillus casei) 的存活影响较小，而 pH 值为1. 5、2. 0 时对其存活率影响很大26 本试验中植物乳杆菌 LS61 在 pH 值为2. 5 4. 5 的 MS 培养基中处理 4. 5 h 后，活