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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流总RNA纯化试剂盒说明-中文版.精品文档.总RNA纯化试剂盒 产品说明书此款RNA纯化试剂盒提供了一种从培养的动物细胞、组织样品、血液、细菌、酵母、真菌、植物和病毒中快速提取和纯化总RNA的方法，。该试剂盒可以纯化所有大小的RNA，从大的mRNA和核糖体RNA到小RNA（microRNA或miRNA）和小干涉RNA（siRNA）。RNA优先从蛋白等的细胞组分中纯化出来，而不使用抑制的苯酚或者氯仿。纯化的RNA是高度完整的，可以应用到一系列的下游应用试验中，包括实时PCR，Northern免疫印迹分析，RNase保护实验和引物延伸，以及表达芯片
2、分析。纯化技术纯化的基础是旋转柱色谱法，用特有的树脂作为分离介质。RNA优先从其他细胞组分（如蛋白质）中分离出来，而不使用苯酚或者氯仿。纯化步骤包括首先用合适的裂解液融解细胞或组织，然后裂解液中加入乙醇后上样到旋转柱中。树脂结合RNA是基于离子的浓度，所以只有RNA结合到柱子上而所有剩余的蛋白和其他的污染物会在流动液中而被除去或者仍在树脂的顶部。然后结合的RNA用试剂盒提供的洗涤液洗涤以除去所有残余的杂质，然后纯化的总RNA用抽提缓冲液洗涤。纯化的RNA是高度完整的，可以用于一系列的下游实验分析。说明试剂盒说明书柱子结合容量50 g柱子最大上样体积600 L纯化RNA大小所有大小，包括小RNA
3、（200nt）起始材料最大量动物细胞动物组织血液细菌酵母真菌植物组织3106个细胞10mg（对于大部分组织*）100L1109个细胞1108个细胞50mg50mg完成10次纯化时间20 min平均收率HeLa细胞（1106个细胞）E.coli（1109个细胞）15 g50 g优点 使用旋转柱提取，步骤快且简单 提取总RNA，从大的核糖体RNA（rRNA）到小（RNAmicroRNA或者miRNA) 不需要苯酚或氯仿作提取液 从多种种类来源样品中提取高质量的总RNA 可以提取和检测到的RNA组织样品可以小到单个动物细胞试剂盒成分成分50 preps裂解液40 mL洗涤溶液22 mL抽提缓冲液6
4、mL微型旋转柱50收集管50抽提管(1.7 mL)50产品说明书1储存条件和产品稳定性所有的溶液需在室温密闭保存。所有的试剂在不开封条件下稳定保存年。预防措施和警告事项该试剂盒只为科研目的设计，不可用于人或者临床。要确保有合适的实验服，在操作化学试剂时一次性的手套和护目镜会磨损。需要更多信息，请参考适合的材料安全表（MSDSs）。所有人和动物组织的问题是要考虑到潜在的感染。当操作全血样品时，所有在使用国家的有关当局建议的预防措施都要执行。用户自备试剂和设备你需要有以下所需材料才可以使用总RNA纯化试剂盒对于所有材料的实验步骤 台式离心机 95 - 100% 乙醇 -巯基乙醇对于动物细胞实验步骤
5、 PBS（无RNase）对于动物组织的实验步骤 液氮 研钵和研杵 70% 乙醇对于鼻喉抹片样品的实验步骤无菌，一次性抹片对于细菌的实验步骤 含溶菌酶的TE缓冲液l 对于革兰氏阳性细菌，在TE缓冲液中1mg/mL 溶菌酶l 对于革兰氏阴性细菌，在TE缓冲液中3mg/mL 溶菌酶对于酵母的实验步骤 含有溶细胞酶的重悬浮缓冲液l 50mM Tris pH 7.5l 10mM EDTAl 1M 山梨糖醇l 1 单位/L 溶细胞酶对于真菌的实验步骤 液氮 研钵和研杵 70% 乙醇对于植物的实验步骤 液氮 研钵和研杵 70% 乙醇RNA的操作RNase是降解RNA的稳定性和活性很强的酶。高压灭菌的溶液和玻
6、璃器皿总是不能有效除去这些酶。所以当操作RNA准备工作的第一步就是有一个无RNase的环境。下面这些预防措施是推荐的针对这些酶最好的措施。 操作RNA的地方需远离微生物实验地方 干净的、一次性的手套在拿放试剂、样品、移液管、一次性离心管等时会损坏。因此建议经常更换手套以避免污染 需要有RNA专用的溶液、枪尖、实验服、移液管等用具 所有的RNA操作用到的溶液都应用至少0.05%DEPC处理的高压灭菌水或者用分子生物学指定的无RNase水配制 用商用的除RNase的溶液清理表面 当使用提纯的RNA样品时，在用于下游实验过程中确保其在冰上放置流程图用总RNA纯化试剂盒纯化RNA的实验步骤实验步骤所有
7、的离心步骤都用台式离心机完成。不同的步骤需要不同的转速，所以请查看你的离心机的说明书以保证其能提供合适的转速。所有的理性步骤都在室温进行。准确的rpm转速可以用下面的公式计算：这里 RCF=需要用重力加速度（相当于地心引力，单位是g）；r=转子的半径，单位是cm；而RPM=达到所需地心引力时每分钟的转数部分 1. 不同细胞类型来源的裂解液的制备实验前须知l 根据起始材料的不同裂解液的制备步骤也不同（步骤1）.然而之后的步骤则在所有情况中都相同（步骤2-6）。l 请确保在从起始材料开始就要按照正确的实验步骤制备裂解液。l 所有的离心步骤都在台式离心机上，除有注释的地方，都以14,000 x g(
8、14,000 RPM)转速进行。所有的离心步骤都在室温离心。l 变速离心机可以发挥试剂盒的最大性能。如果没有变速离心机，可以用固定转速的离心机，然而这样会减少收率。l 实验前保证所有的溶液都在室温放置l 所有提供的酶在使用前都应在各自的管上内标示的温度下保存l 配制洗涤溶液使用液，在提供的装有洗涤液的瓶内加入50 mL 95%的乙醇（用户自备）。这样总体积为72 mL。瓶子上的标签有一个方框可以用来检查是否已加入乙醇。l 可选：对于大部分的动物细胞组织，尤其是那些已知含较高含量RNase的组织（如胰腺），以及大部分的植物组织和鼻喉抹片样品，强烈建议在裂解液中加入-巯基乙醇。而且也建议想要分离用
9、于高灵敏度的下游实验的RNA的用户。每1 mL 裂解液加入10 L -巯基乙醇（用户自备）。-巯基乙醇有毒性，请在通风橱中操作。否则，使用试剂盒提供的裂解液。l 为提取完整的病毒RNA，如果起始材料是细胞培养物，按照部分1A，如果起始材料是组织，按照部分1B，如果起始材料是血液，按照部分1C，如果起始材料是鼻喉抹片样品，按照1D。对于从无毒的病毒颗粒中提取RNA，按照部分1I。l 操作过程中动作要迅速很重要。1A. 培养的动物细胞裂解液的制备使用前须知l 建议细胞最大的起始用量是3106个细胞。可以用血球计和显微镜对细胞计数。一般来说，普通的3.5cm培养皿可以有106个HeLa细胞。l 收集
10、的细胞沉淀块可以再-70C保存供以后使用，或者在实验中直接使用。在冻存前要对细胞计数。l 冻存的细胞沉淀块不能超过2星期以保证不破坏RNA的完整性。l 冻存的细胞沉淀块在实验步骤开始前不能融解。在冻存的细胞块中直接加入裂解液（步骤 1A（ii）c）。1A(i). 单层培养的细胞裂解液的制备a. 吸弃培养基，然后加入一定量的PBS冲洗细胞层。吸弃PBS。b. 培养皿中直接加入350L裂解液。c. 轻拍培养皿裂解细胞，然后缓冲液在培养皿表面旋转晃动5min。d. 将裂解液转移到离心管内。e. 裂解液中加入200L 95-100% 乙醇（用户自备）。涡旋混匀10秒。进行到步骤2。注意：对于起始细胞量
11、大于106个细胞的样品，建议将裂解液通过装有25号针头的注射器5-10次，以使在上样到柱子前切断基因组DNA。1A(ii). 悬浮培养的和贴壁生长的细胞裂解液的制备a 将培养上清转移到无RNase的离心管中（未提供），然后以最大不超过200g（2000RPM）的转速离心10min沉淀细胞。b 小心地除去上清。留下少许几微升（L）的培养基避免细胞沉淀被吸出。c 细胞沉淀块中加入350L裂解液。涡旋震荡15秒裂解细胞，在进行下一步之前确保所有的沉淀块被完全溶解。d 裂解液中加入200L 95-100% 乙醇（用户自备）。涡旋混匀10秒。进行到步骤2。注意：对于起始细胞量大于106个细胞的样品，建议
12、将裂解液通过装有25号针头的注射器5-10次，以使在上样到柱子前剪断基因组DNA。1B. 动物组织裂解液的制备使用前须知l 总RNA纯化试剂盒是用于从小量的组织样品中提取RNA的试剂盒（大部分实验中最大量达到10mg）。l 动物组织中RNA在组织获取后，剪碎和匀浆之前是不受保护的。因此重要的是操作的步骤要尽量快，尤其是细胞裂解液制备的步骤。l 新鲜组织或者冻存的组织均可。组织应迅速放入液氮中然后尽快转入-70C冰箱，长期保存。组织在-70C中可以保持几个月。在研磨匀浆之前不能使冻存的组织融解以保证RNA的完整性。l 组织应在RNA稳定液中保存，如RNAlater可以和提取步骤兼容。在提取步骤之
13、前用镊子将组织小心从储存液中取出，沥干多余的液体。l 组织类型不同，组织最大用量也不同，请参考以下的表格1以确定最大的组织用量。如果你的组织在表格中没有包括，我们建议初始的用量不超过10mg。表1.不同组织的推荐最大起始用量组织最大起始用量脑25mg心脏5mg肾10mg肝10mg肺10mg脾脏10mg1B. 动物组织细胞裂解液的制备a.从动物中分离组织样品b.称量组织重量。请请参考以下的表格1以确定不同组织的最大量。对于表格中没有包括的组织样品我们建议初始的量不超过10mg。c.将组织转移至有适量液氮的研钵内，液氮应覆盖过组织。用研杵充分充分研磨组织。d.使研钵内液氮蒸发而不使组织融解。e.
14、组织样品中加入400L裂解液后继续研磨直至样品均匀。将裂解液通过装有25号针头的注射器5-10次使之均匀。f. 用吸管将裂解液转移至无核酸酶的离心管内（离心管未提供）。g. 离心2min使细胞碎片沉淀。然后上清转移至另一个无核酸酶的离心管。记录上清/裂解液的体积。h. 收集的裂解液中等体积加入70%的乙醇（每100L裂解液加入100L乙醇）。漩涡混匀。继续进行步骤21C. 血液裂解液的制备实验前须知l 所有人和动物组织的问题是要考虑到潜在的感染。当操作全血样品时，所有在使用国家的有关当局建议的预防措施都要执行l 建议血液的最大用量不能超过100L，避免堵柱。l 我们建议试剂盒用于从非凝集的新鲜
15、血液中提取RNA，用EDTA作为抗凝剂。l 实验过程中操作要迅速。1C. 血液样品裂解液的制备a. 将100L未凝集的血液样品转移到无RNase的离心管中（未提供）。b. 血液中加入350L裂解液。震荡裂解细胞15秒。在进行到下一步之前保证整个混合物都变透明。c. 裂解液中加入200L 95-100%乙醇（用户自备）。震荡混匀10秒。进行到步骤2。1D. 鼻喉抹片样品裂解液的制备使用前须知l 所有人和动物组织的体液都是有潜在的感染性。当操作这些样品时，所有在使用国家的有关当局建议的预防措施都要执行l 实验过程中操作要迅速。1D. 鼻喉抹片样品裂解液的制备a. 将600L裂解液加入到无RNase
16、的离心管中（未提供）。b. 用无菌，一次性的棉签在鼻或喉等组织内轻轻擦。c. 用无菌的器具剪掉收集有鼻喉细胞的棉签头，放入到加有裂解液的离心管中。盖上管盖，室温轻轻震荡孵育5min。d. 用吸管将裂解液上清转移到无RNase的离心管内（未提供）。记录裂解液的体积。收集的裂解液中等体积加入70%乙醇（每100L裂解液加入100L乙醇）。漩涡混匀。继续进行步骤21E.细菌裂解液的制备使用前须知 按照表格2配制含溶菌酶的TE缓冲液。该溶液需用无菌的，无核酸酶的TE缓冲液配制，然后在冰上放置备用。使用者自己提供这些试剂。 在此步骤中建议最多用109个细菌细胞。用分光光度计测量细菌的生长情况。一般大肠杆
17、菌OD600 1.0，浓度是1 x 109 cells/mL。 对于RNA提取，应该在对数生长期收获细菌。细菌沉淀块可在-70C保存以后使用，或者直接使用。冻存的细菌菌块在开始操作之前不能融解。将含溶菌酶的TE缓冲液直接加入冻存的细菌菌块中（步骤1Ec）。1E.细菌细胞裂解液的制备a. 14,000 x g (14,000 RPM)离心1min收集细菌。b.吸弃上清，然后尽量小心移走剩余的培养基。c.用100L含溶菌酶的TE缓冲液漩涡震荡重悬细菌（见表1）。见表1时间室温温育。d.加入300L裂解液，漩涡充分震荡至少10秒。e.加入200L 95-100%的乙醇(用户自备)到裂解液中。漩涡充分
18、震荡至少10秒。继续进行步骤2表2：不同细菌类型的孵育时间细菌类型TE缓冲液中溶菌酶浓度孵育时间革兰氏阳性细菌1 mg/mL5min革兰氏阴性细菌3 mg/mL10min1F.酵母菌裂解液的制备使用前须知l 制备一定量的含溶细菌酶的重悬液，考虑到每次需要100L的溶液。重悬液需含有以下成分：50mM Tris pH 7.5，10mM EDTA，1M 山梨糖醇，1% -巯基乙醇，1 单位/L 溶细胞酶。溶液需要用无菌，无RNase试剂制备，然后在冰上放置直至使用。这些试剂需要用户自己提供。l 该实验建议使用的酵母菌细胞不超过107个细胞或者1mL培养液。l 对于提取RNA，需要收取对数生长期的酵
19、母细胞。l 酵母可以可在-70C保存以后使用，或者直接使用。l 冻存的酵母菌菌块在开始操作之前不能融解。将含溶细胞酶的重悬液直接加入冻存的细菌菌块中（步骤1Fc）。1F.细胞裂解液的制备a. 14,000 x g (14,000 RPM)离心1min收集酵母菌菌块。b.吸弃上清，然后尽量小心移走剩余的培养基。c.用100L含溶细胞酶的重悬液完全重悬酵母细胞，漩涡震荡重悬。37C孵育10min。d.加入300L裂解液，漩涡充分震荡至少10秒。e.加入200L 95-100%的乙醇(用户自备)到裂解液中。漩涡充分震荡至少10秒。继续进行步骤21G.真菌裂解液的制备使用前须知l 新鲜或者冻存的真菌菌
20、块均可使用。真菌样品应迅速放入液氮中然后尽快转入-70C冰箱，长期保存。真菌样品组织在-70C中可以保持几个月。在研磨匀浆之前不能使冻存的组织融解以保证RNA的完整性。l 该实验中建议真菌的用量不超过50mg，以避免堵柱。1G.真菌裂解液的制备a. 称重决定真菌的量。建议该实验步骤中真菌的用量不能超过50mgb. 将真菌块转移到有一定量液氮的研钵中，液氮要覆盖过组织。用研杵充分研磨真菌细胞。 注意：该步骤研磨的真菌可以在70C保存，以后再进行RNA提取的步骤。c. 使研钵内液氮蒸发而不使组织融解。d. 组织样品中加入600L裂解液后继续研磨直至样品均匀。e. 用吸管将裂解液转移至无核酸酶的离心
21、管内（离心管未提供）。f. 离心2min使细胞碎片沉淀。然后上清转移至另一个无核酸酶的离心管。记录上清/裂解液的体积。g. 收集的裂解液中加入等体积的70%乙醇（用户自备），（每100L裂解液中加入100L乙醇）。震荡充分混匀。继续进行步骤21H.植物细胞裂解液的制备使用前须知l 建议植物组织的样品最大量是50mg或者是5106个植物细胞。l 新鲜或者冻存的植物组织均可使用。植物样品应迅速放入液氮中然后尽快转入-70C冰箱，长期保存。植物样品在研磨匀浆之前不能使冻存的组织融解以保证RNA的完整性。l 实验操作动作要迅速。1H.植物细胞裂解液的制备a. 将小于等于50mg或者5106的植物样品转
22、移到有一定量液氮的研钵中，液氮要覆盖过组织。用研杵充分研磨真菌细胞。 注意：如果要保存冻存的组织，在将组织转移到液氮之前不能使组织融解。b. 使研钵内液氮蒸发而不使组织融解。c. 植物组织样品中加入600L裂解液后继续研磨直至样品均匀。d. 用吸管将裂解液转移至无核酸酶的离心管内（离心管未提供）。e. 离心2min使细胞碎片沉淀。然后上清转移至另一个无核酸酶的离心管。记录上清/裂解液的体积。f. 收集的裂解液中加入等体积的70%乙醇（用户自备），（每100L裂解液中加入100L乙醇）。震荡充分混匀。继续进行步骤21I.病毒裂解液的制备使用前须知l 为提取完整的病毒RNA，如果起始材料是细胞培养
23、物，按照部分1A，如果起始材料是组织，按照部分1B，如果起始材料是血液，按照部分1C，如果起始材料是鼻喉抹片样品，按照1D。l 建议使用最多不超过100L的病毒颗粒悬液，以避免堵柱。l 实验操作动作要迅速。1L.病毒裂解液的制备a. 将100L的病毒颗粒悬液转移至一个无核酸酶的离心管中（未提供）。b. 样品中加入350L裂解液，振荡15秒裂解细胞。在进行下一步之前保证整个混合液变为透明。c.裂解液中加入200L的95-100%乙醇（用户自备），震荡充分混匀10秒。继续进行步骤2部分2. 从各种裂解液的纯化总RNA注意：对于这之前不同类型的裂解液制备，从该步骤开始剩下的纯化总RNA的步骤都相同。
24、2. RNA结合到柱子上a. 用提供的收集管装柱b. 将最多600 L 裂解液和乙醇（来自步骤1）上柱，然后离心1min注意: 确定所有的裂解液通过柱子进入收集管。如果裂解液没有完全通过，再离心甩1min。c. 弃去流动液。用另一收集管重新装柱。d. 根据你的裂解液体积，重复步骤2b和2c。可选步骤：总RNA纯化试剂盒提取的总RNA带有少量的基因组DNA污染。然而，可以选择附A中进行柱上DNA处理步骤，以最大量地除去残余的DNA，它可能会影响下游灵敏的实验。在该实验中，这一步骤必须在此步骤进行。3.柱子洗涤a. 将400L含有DNase 1的洗涤溶液上柱，离心1min。注意：确定所用的洗涤溶液
25、通过柱子进入收集管内。如果整个洗涤液没有完全通过，再离心1min。b. 弃去流动液，用另一收集管重新装柱。c. 重复步骤3a和3b再次洗柱。d. 再用400L洗涤液第三次洗柱，然后离心1min。e. 弃去流动液，用另一收集管重新装柱。f. 离心甩柱2min 使树脂充分变干。抛弃收集管。4. RNA抽提 a. 将柱子放入试剂盒提供的1.7 mL抽提管中。 b. 柱子加入50 L抽提液。 c. 200 x g (2,000 RPM)离心2min，然后再14,000 x g(14,000 RPM)离心1min。注意从柱子中流出的抽提液，如果不足总体积50 L，柱子再次14,000 x g(14,00
26、0 RPM)离心1min。注意：为得到RNA最大收率，建议用不同的离心管做第二次抽提（重复步骤4b和4c）。5. RNA保存纯化的RNA样品可以在20C保持数日。建议样品在70C保存更长时间。附录 A可选的柱上DNA去除DNA步骤总RNA纯化试剂盒提取的总RNA带有少量的基因组DNA污染。然而，可以选择附A中进行柱上DNA处理步骤，以最大量地除去残余的DNA，它可能会影响下游灵敏的实验。在该实验中，这一步骤必须在此步骤进行。1. 按照操作手册的说明配制0.25 K/L 无RNase的DNase 1的溶液的应用液。每处理一根柱子要用掉100L溶液。或者，用反应液溶解或稀释DNase 1储液（40
27、 mM Tris pH 7.0，10 mM MgCl2 和3 mM CaCl2，无RNase制备）制成最终浓度为0.25 K/L。2. 从起始材料开始到结合到柱子（步骤1和2的所有步骤）上都要正确按照总RNA提取的步骤操作。3. 柱子上加入400L洗涤液然后离心2min。弃去流动液。用收集管装柱。4. 然后100 L 按照步骤1配制的无RNase的DNase 1上柱，14,000 x g (14,000 RPM) 离心 1 minute.注意：确定所有DNase 1混合液过柱。如果需要，再次14,000 x g (14,000 RPM)离心1min。5. 在步骤5 离心后，将收集管中流动液用移
28、液管转移到柱子顶部。注意: 一定要进行步骤5 以发挥DNase 最大活性和得到RNA最大收率，尤其是小RNA的收率、6. 柱子装置在15-30孵育15min。7. 不需要再进行离心，直接进入到柱子“洗涤步骤”（步骤3）疑难指导问题可能原因解决方法和解释RNA收率低细胞或组织裂解不完全确保一定量的细胞或者组织用适量的裂解液堵柱起始材料的用量不要用超过建议的用量。如果柱子在建议的水平下堵柱，应减少起始材料的量。也可以参见下面的“堵柱”问题使用了代替的抽提液建议使用试剂盒提供的抽提液以得到最大的RNA收率洗涤液中没有加入乙醇在结合到柱子上之前保证加入了一定量的乙醇细胞或组织中RNA含量低不同的组织和
29、细胞中RNA含量不同，因此不同来源的材料预期达到的RNA量也就不同。请查阅文献以确定你所用起始材料的RNA预期的量。细胞培养物：单层培养的细胞没有用PBS洗涤确保用一定量的PBS洗涤单层培养的细胞以从细胞中除去残余的培养基酵母细胞：重悬液中没有加入溶细胞酶当配制重悬液时确定加入一定量的溶细胞酶细菌和酵母细胞：培养基残余成分没有除去在加入裂解液之前确保所有的培养基已除去堵柱细胞或组织融解不充分确保一定量的细胞或者组织用适量的裂解液细胞的最大数或者组织的最大量超过了试剂盒的说明书的量如果起始材料没有在试剂盒说明书内包括，请参考说明以决定用量在样品中存在多的基因组DNA将裂解液通过装有25号针头的注
30、射器5-10次以使基因组DNA在柱子上样前切断基因组DNA离心温度太低确保实验的离心温度是室温。低于15C温度会产生沉淀而堵柱。RNA降解RNase污染在使用该试剂盒时可能引入RNase。当操作RNA时确保按照正确的步骤操作。请实验前参考“RNA的操作”。实验进行得不够快为保持RNA的完整性，重要的是要操作要快。尤其是实验方案中细胞裂解液准备步骤，因为动物组织中RNA在组织获取后，剪碎和匀浆之前是不受保护的。纯化RNA的不当保存对于短期保存的RNA样品应在20C保存数日。建议样品在70C保存可以保持更长时间冻存的组织在分离RNA之前融化在用研钵和研杵研磨之前不能使冻存的组织融化，以保证RNA的完整性。起始材料中RNase含量高对于RNase含量高的起始材料，建议裂解液中加入-巯基乙醇溶菌酶或者溶细胞酶可能含有RNase确保该试剂盒使用的溶菌酶或者溶细胞酶不含有RNase，以防止可能出现的RNA降解问题在下游实验中RNA质量不好RNA没有用提供的洗涤液洗涤3次如果柱子没有用洗涤液洗涤2次，自结合步骤后的盐仍在样品中。盐可能干扰下游实验，因此需要从柱子上洗出。带有乙醇在柱子洗涤步骤没有旋转甩干柱子，这样可以在抽提前除去乙醇。据所知乙醇可能干扰下游实验。有基因组DNA污染材料起始用量过大实验步骤中用无RNase的DNase1处理RNA样品，从而除去基因组DNA的污染。