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1、_ 细胞线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途 细胞线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂是一种旨在通过线粒体钙离子特异性荧光探针Rhod-2，与钙离子结合后，其荧光强度显著增强，在荧光分光光度仪下观察相对荧光峰值的变化，来测定细胞线粒体中总钙离子浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞（动物、人体等）内线粒体钙离子的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。技术背景钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99的钙以氟磷灰石钙（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于
2、骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40至50的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexed calcium）和离子钙（ionized calcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。在细胞内，钙离子主要储存在线粒体和内质网等细胞器中。其中线粒体钙离子在调节线粒体代谢、保持线粒体的ATP产量达到细胞需求，维持细胞内环境钙离子平衡方面起着重要作用。线粒体钙的检测包括沉淀
3、法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技术，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求，以及需要线粒体纯化。Rhod-2，罗丹明123（rhodamine 123）的衍生产物，一种与钙离子结合产生荧光，同时其正电荷特性，特异性地聚集在线粒体里， 由此用于测定线粒体内钙离子水平。在荧光分光光度仪下，激发波长550nm，散发波长590nm，来定量测定线粒体的钙浓度。产品内容 清理液（Reagent A） 40毫升 染色液（Reagent B） 30微升 介导液（Reagent C） 600微升 饱和液（Reagent D
4、） 2毫升 阴性液（Reagent E） 2毫升产品说明书 1份保存方式保存 染色液（Reagent B）和 介导液（Reagent C）在20冰箱里，避免光照；其余的保存在4冰箱里；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器细胞培养箱：用于染色孵育黑色96孔板：用于样品操作的容器荧光酶标仪：用于荧光分析（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光染色观察实验步骤一、 测定准备1 设定好荧光酶标仪（22）：激发波长550nm，散发波长590nm2 测定开始前，将20冰箱里的试剂盒中的 染色液（Reagent B）室温下融化，然后分别移出30微升 介导液（Reagent C）和1.5微升 染色
5、液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，标记为 染色工作液，并放在暗室里备用。然后进行下列操作。 二、荧光酶标仪检测1 准备1个黑色96孔细胞培养板，标记为：细胞样品孔、空白对照孔（不含细胞）、最大对照孔（不含细胞）2 小心抽去细胞样品孔的培养液3 加入100微升 清理液（Reagent A）到细胞样品孔里4 加入100微升 饱和液（Reagent D）到最大对照孔里5 加入100微升 阴性液（Reagent E）到空白对照孔里6 分别加入10微升 染色工作液到所有孔里7 轻轻摇动酶标板，混匀8 室温下（22），孵育30分钟，避免光照9 放进37细胞培养箱里孵育30分钟，避免光照10
6、小心抽去细胞样品孔里的上清液11 小心加入100微升 清理液（Reagent A）到细胞样品孔里12 重复实验步骤12和13一次 13 放进37细胞培养箱里孵育30分钟14 即刻放进荧光酶标仪测读：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU） 15 计算样品线粒体钙离子浓度 【（样品RFU空白对照孔RFU）（最大对照孔RFU样品RFU）】X 570（纳摩尔；解离常数）三、（共聚焦）或荧光显微镜检测1 准备1个待测的细胞爬片样品2 小心加上500微升 清理液（Reagent A），覆盖样品表面3 小心移去样品上的 清理液（Reagent A）4 移取300微升
7、 清理液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管5 加入30微升 染色工作液，混匀 6 小心加上上述 染色工作液到样品上，覆盖样品表面7 室温下（22），孵育30分钟，避免光照8 放进37细胞培养箱里孵育30分钟，避免光照9 小心移去样品上的 染色工作液10 小心加上500微升新鲜的 清理液（Reagent A）11 小心移去 清理液（Reagent A）12 小心加上500微升新鲜的 清理液（Reagent A）13 放进37细胞培养箱里孵育30分钟14 小心移去 清理液（Reagent A）15 盖上盖玻片16 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长550nm，散发波长590nm（线粒体钙离子呈现红色）注意事项1 本产品为20次（显微镜）或60次（96孔板）操作2 操作时，须戴手套3 避免使用EDTA等处理样品4 孵育反应完成后即刻进行荧光测定 5 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度6 检测敏感度可达纳摩尔级钙浓度范围7 可以使用荧光分光光度仪检测8 本公司提供系列钙生化检测试剂产品质量标准1 本产品经鉴定性能稳定2 本产品经鉴定检测敏感6_