《连接分子生物学实验学习教案.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《连接分子生物学实验学习教案.pptx（25页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、会计学1连接连接(linji)分子生物学实验分子生物学实验第一页，共25页。第1页/共25页第二页，共25页。计算公式计算公式:待测样品的待测样品的DNADNA量量(ng)(ng)=Marker Marker DNADNA总质量总质量同等亮度条带的同等亮度条带的MarkerMarker的的bpbp数数MarkerMarker各条各条带带bpbp数总和数总和X第2页/共25页第三页，共25页。DNADNA片段片段(pin (pin dun)dun)的重组的重组（连接反应）（连接反应）实实 验验 四四第3页/共25页第四页，共25页。背景背景(bijng)理论知识理论知识Section 1第4页/
2、共25页第五页，共25页。BamHINotIpET28a5.37kbBamHI（661）NotI（1398）pEGFP-N34.7kbEGFP(720bp)EGFP(720bp)-BamHI-NotIpET28a(5.3kb)-BamHI-NotILigation第5页/共25页第六页，共25页。1.1.学习克隆工作中常用的单、双酶切，载体去学习克隆工作中常用的单、双酶切，载体去磷酸化处理等连接方法磷酸化处理等连接方法2.2.了解反应中各因素对连接效率了解反应中各因素对连接效率(xio l)(xio l)的影的影响响第6页/共25页第七页，共25页。4.1.2【实验(shyn)原理】DNA重组
3、(zhn z)：在DNA连接酶的作用下,在含有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接,获得重组(zhn z)DNA分子。第7页/共25页第八页，共25页。T4DNAT4DNA连接酶：连接酶：ATPATP是辅是辅助因子；助因子；大肠杆菌大肠杆菌(d chn n (d chn n jn)DNAjn)DNA连接酶连接酶NAD+NAD+是辅是辅助因子。助因子。第8页/共25页第九页，共25页。4.1.2【实验(shyn)原理】第9页/共25页第十页，共25页。4.1.2【实验(shyn)原理】第10页/共25页第十一页，共25页。n反应温度反应温度(wnd
4、)(wnd)：最佳温度：最佳温度(wnd)37(wnd)37C Cn一般一般采用采用4-16 4-16 C C第11页/共25页第十二页，共25页。第12页/共25页第十三页，共25页。化化n（CIPCIP小牛肠碱性小牛肠碱性磷酸酶）磷酸酶）第13页/共25页第十四页，共25页。定向克隆定向克隆返回返回(fnhu)第14页/共25页第十五页，共25页。第15页/共25页第十六页，共25页。第16页/共25页第十七页，共25页。4.1.44.1.4载体载体(zit)(zit)、供体浓度、供体浓度及比例及比例重组重组DNADNA片段摩尔比例片段摩尔比例(bl)(bl)的换算：的换算：100ng p
5、ET28a (5.3kb) 100ng pET28a (5.3kb) ：100ng eGFP(0.7kb100ng eGFP(0.7kb）= =？ 1 : 7.5 1 : 7.5第17页/共25页第十八页，共25页。实验实验(shyn)操作操作Section 2第18页/共25页第十九页，共25页。第19页/共25页第二十页，共25页。将插入片段与载体(zit)片段按3:1的比例 载体(zit) 2l (100ng) 目的片段(1.4kb) ?l (100ng)6l T4连接酶缓冲液 1l T4连接酶 1l ddH2O 0l 反应总体积 10l混合于EP管(标记)中且混匀,Short离心4.2
6、.2【实验(shyn)步骤】第20页/共25页第二十一页，共25页。16 C保温保温(bown)14 小时小时,若不马若不马上转化上转化, -20 C保存保存该连接产物是下次实验(shyn)材料第21页/共25页第二十二页，共25页。思思 考考 题题 单酶切重组单酶切重组DNADNA有哪些弊端，如何有哪些弊端，如何(rh)(rh)避避免？免？ 在不计算在不计算DNADNA片段浓度的情况下，如何片段浓度的情况下，如何(rh)(rh)快速简便的估算连接片段的比例？快速简便的估算连接片段的比例？第22页/共25页第二十三页，共25页。下下 次次 实实 验验感受态细胞感受态细胞(xbo)(xbo)的制备与的制备与重组重组DNADNA的转化的转化第23页/共25页第二十四页，共25页。开始开始(kish)工作吧工作吧！LETS BEGIN NOW！第24页/共25页第二十五页，共25页。