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1、重点掌握：1.转录的反应体系 2.原核生物和真核生物中的RNA聚合酶的特点 3.原核生物和真核生物启动子的特点 4.RNA的转录过程大体可分为起始、延长、终止三阶段。5.真核生物前体mRNA的加工，特别是内含子的剪接类型及方式难点：1.原核及真核生物的转录起始，原核及真核生物的转录终止 2.内含子的剪接类型、方式及剪接过程【学习目的与要求学习目的与要求】第1页/共139页 一一个个细细胞胞要要行行使使其其正正常常的的功功能能，细细胞胞内内相相关关的的基基因因必必需需表表达达，基基因因表表达达就就要要产产生生相相应应 的的 RNARNA产产 物物 或或 蛋蛋白白质质。基基因因表表达达的的完完成成
2、须须通通过过遗遗传传信信息息从从DNADNA到到RNARNA，或或再再从从 RNARNA到到 蛋蛋 白白 质质（图（图4 4 1 1）图41 基因表达过程 前言前言第2页/共139页RNA分子以DNA分子的一条链为模板在依赖于DNA的RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase)催化下合成。这种RNA聚合酶与DNA聚合酶不同，可以从头起始新生RNA链的合成（不需要引物）。第3页/共139页RNA分子的合成被起始、被延长和被终止的过程叫转录。从转录的起始部位（启动子）到终止部位（终止子）的脱氧核苷酸序列称为转录单位。转录的第一个核苷酸定义为+1，5端相邻的上游(upst
3、ream)核苷酸为负值，3端下游序列(downstream)为正值，没有0位。转录按照53方向进行。通常，mRNA的第一个碱基不是编码蛋白质序列的第一个碱基，因为存在5-非翻译区（5-untranslated region 5-UTR）和3-非翻译区（3-untranslated region 3-UTR）（图42）。第4页/共139页 图 42基因转录的上游和下游区域第5页/共139页 转录须从三个方面进行讨论：转录须从三个方面进行讨论：第一是转录的酶学第一是转录的酶学 第二是决定转录在第二是决定转录在DNADNA分子上的什么位点开始和停止分子上的什么位点开始和停止的信号的信号 第三对于第三
4、对于RNARNA转录后加工成熟过程中，一个最主要的转录后加工成熟过程中，一个最主要的问题是如何保证内含子剪接反应的准确性。问题是如何保证内含子剪接反应的准确性。第6页/共139页第一节第一节第一节第一节 RNARNA的酶促合成的酶促合成的酶促合成的酶促合成一、RNA合成（转录）的基本特征1合成RNA的底物是5-三磷酸核苷酸(NTP)，包括ATP、GTP、CTP和UTP，每个NTP的3位和2位碳原子上都有一个-OH。2在RNA聚合酶作用下一个NTP的3-OH和另一个NTP的5-P反应，去掉焦磷酸，形成磷酸酯键。3RNA的碱基顺序由DNA的顺序决定，且依靠NTP与DNA上的碱基配对的亲和力被选择，
5、这一点与DNA复制相同，只是T由U代替。4.在开始被转录的双链DNA分子的任何一个特定区域都是以单链为模板。第7页/共139页5 5RNARNA合成的方向是从合成的方向是从5-35-3，单核苷酸只加到，单核苷酸只加到3-3-OHOH上，上，RNARNA链与模板链呈反向平行。与链与模板链呈反向平行。与RNARNA互补的互补的DNADNA单单链被称为模板链（反义链），极性方向和链被称为模板链（反义链），极性方向和RNARNA相反。而相反。而与与RNARNA分子极性方向相同的被称为非模板链（有义链或分子极性方向相同的被称为非模板链（有义链或编码链），因为从非模板链上可看出编码链），因为从非模板链上可
6、看出RNARNA分子的序列，分子的序列，并可直接推测出其编码的氨基酸序列，所以称为有义链并可直接推测出其编码的氨基酸序列，所以称为有义链（图（图4 41 1）。）。第8页/共139页6 6在在RNARNA的合成中不需要引物，它能从头合成的合成中不需要引物，它能从头合成RNA(RNA(这一点与这一点与DNADNA的合成不同的合成不同)。7 7只有只有5-5-三磷酸核苷酸掺入到三磷酸核苷酸掺入到RNARNA的合成中，的合成中，起始转录处的第一个核苷酸是起始转录处的第一个核苷酸是5-5-三磷酸，其三磷酸，其3-OH3-OH是下是下个核甘酸的接触点，这样合成的个核甘酸的接触点，这样合成的RNARNA分
7、子的分子的5-5-末端具有三磷酸。末端具有三磷酸。第9页/共139页转录不如复制精确，缺乏广泛的校正机制，尽管确实存在两种转录不如复制精确，缺乏广泛的校正机制，尽管确实存在两种RNARNA合成合成的校正形式；复制必须将整个基因组全部拷贝，并且细胞每次分裂时的校正形式；复制必须将整个基因组全部拷贝，并且细胞每次分裂时只进行一次。而转录却是有选择性的，转录区域的选择不是随机的，只进行一次。而转录却是有选择性的，转录区域的选择不是随机的，转录区域通常包括一个或几个基因。不仅基因组的不同部分转录的程转录区域通常包括一个或几个基因。不仅基因组的不同部分转录的程度不同，而且转录哪一部分、转录的范围多大都是
8、可以调节的。度不同，而且转录哪一部分、转录的范围多大都是可以调节的。此外，此外，RNARNA聚合酶合成几个核苷酸之后，便将正在延长的聚合酶合成几个核苷酸之后，便将正在延长的RNARNA链从模板上质换下来。这一置换对链从模板上质换下来。这一置换对RNARNA翻译产生蛋白质和多个翻译产生蛋白质和多个RNARNA聚合酶分子可以一个紧接着另一个同时转录同一个基因是聚合酶分子可以一个紧接着另一个同时转录同一个基因是非常关键的。这样，一个细胞就可在短时间内合成同一个基因的非常关键的。这样，一个细胞就可在短时间内合成同一个基因的大量产物。大量产物。第10页/共139页二、大肠杆菌RNA聚合酶(E.coli
9、RNApolymerase)n 大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶有多亚基组成，聚合酶有多亚基组成，RNA聚合酶全酶聚合酶全酶（holoenzyme）有）有6个亚基（个亚基（2）组成，除）组成，除亚亚基有两个外，其余亚基只有基有两个外，其余亚基只有1个，个，亚基很容易从全酶上亚基很容易从全酶上掉下来，掉下来，亚基在酶作用的某个阶段掉下来之后，剩下亚基在酶作用的某个阶段掉下来之后，剩下的的2，称为核心酶，称为核心酶(core enzyme)，全酶分子量大，全酶分子量大约为约为465 kD（图（图4-3）。）。第11页/共139页图43 大肠杆菌RNA聚合酶的结构 是识别因子，在Ecoli中，rRNA、
10、tRNA和mRNA均由同一种酶即RNA 聚合酶（2）催化合成。第12页/共139页表41大肠杆菌RNA聚合酶组成 亚亚 基基每个酶分子含每个酶分子含有的数目有的数目 基因基因 分子量分子量 可能的功能可能的功能 2rpoA40 kD参与启动子的识别与参与启动子的识别与结合结合 1rpoB155 kD聚合活性，负责催化聚合活性，负责催化RNA的合成。的合成。1rpoC160 kD与与DNA模板结合模板结合 1rpoD32-90 kD转录起始识别转录起始识别 1rpoZ11 kD可能参与保护可能参与保护亚基亚基第13页/共139页 在在RNARNA聚合酶的亚基结构中，聚合酶的亚基结构中，、和和亚亚
11、基对酶活性是必需的，是核心酶的主要成分。基对酶活性是必需的，是核心酶的主要成分。核心酶具催化活性，为与启动子的特定区域结核心酶具催化活性，为与启动子的特定区域结合，核心酶还需与其他亚基结合才能识别正确合，核心酶还需与其他亚基结合才能识别正确的启动子区域，这个亚基称为的启动子区域，这个亚基称为因子，因子，其作用其作用是识别是识别DNADNA分子上分子上RNARNA合成的起始信号。合成的起始信号。第14页/共139页三、RNA聚合酶在DNA上的识别结合位点1启动子(promoter)转录的第一步就是RNA聚合酶结合到DNA分子上，发生结合并在此起始转录的特殊位置叫启动子。一系列的相互作用必须在启动
12、子处发生，RNA聚合酶必须识别一个特殊的DNA顺序，接触到一个合适的构型中，打开DNA双螺旋从而进入其中对其碱基进行拷贝，接着启动RNA的合成。第15页/共139页已知这个过程可归纳为三点已知这个过程可归纳为三点：RNARNA聚合酶对一个识别位点进行模板结合。聚合酶对一个识别位点进行模板结合。聚合酶移动到起始位点。聚合酶移动到起始位点。形成一个开放启动子复合物形成一个开放启动子复合物(open-promoter(open-promoter complex)complex)。分离不同基因的启动子并测定它们的碱基。分离不同基因的启动子并测定它们的碱基顺序顺序,发现不同的启动子的启动区的非编码链有发
13、现不同的启动子的启动区的非编码链有6 6个碱基个碱基(TATAAT)(TATAAT)是很一致的。是很一致的。第16页/共139页2-10区(Pribnow box)大肠杆菌(E.coli)和大肠杆菌噬菌体的几个基因的启动子所具有的序列，在左边距mRNA开始转录的第一个碱基5-10个碱基的地方有一段序列叫Pribnow box(简称PB)即-10区典型的-10区序列为TATAAT，-10区的第六个碱基是绝对保守的，全是T。-10区是RNA聚合酶的紧密结合位点。目前认为-10区决定转录的方向。在-10区，DNA双螺旋解开与RNA聚合酶形成开放启动子复合物。Pribnow box在-134之间。其一
14、致性序列为：TATAAT。第17页/共139页图图4 4 4 RNA4 RNA聚合酶和启动子聚合酶和启动子-10-10区紧密结合，区紧密结合，形成一个开放启动子复合物形成一个开放启动子复合物第18页/共139页 Promoter region including Sextama Box:RNApol.recognition site(R site)TTGACA(Sextama Box)-35 site RNApol.loosely binding sitePribnow Box:TATAAT(pribnow Box)-10 site RNApol.firmly binding site(B s
15、ite)Initiation site:+1 RNA transcriptional startpoint(I site)A/G-35(R)-10(B)+1(I)RNA第19页/共139页第20页/共139页3-35区(sextama box)-35区位于-10区左侧，是启动子中另一个重要的区域，在-35区也存在与-10区类似的一个序列，这个一致性序列是：TTGACA。目前认为RNA聚合酶首先识别并结合于-35区，然后移向-10区，普遍认为RNA聚合酶结合后沿着DNA滑动，另一个可能性是，亚基首先在高度专一性的顺序-35区左边的识别位点结合，然后，由于RNA聚合酶的巨大体积而能进入到-10区，
16、如图4-4所示。RNA聚合酶一旦进入到-10区，就从左边的识别位点解离出来，和-10区紧密结合，形成一个开放启动子复合物。第21页/共139页 R -35 B-10I+1 Sextama BoxPribnow BoxInitiation第22页/共139页 根据目前已测知的强、弱启动子之间的差别就在于-35区的顺序不同。此外，-10区和35区之间的距离对启动子的强弱也有关系。在测定了100个不同的启动子的顺序后，发现-10区和-35区之间的距离90以上是1618bp，相距17bp的启动子是最强的。我们把启动子归类为强启动子和弱启动子来进行讨论。弱启动子被RNA聚合酶识别的效率较低，合成的mRN
17、A的数目也比强启动子合成的要少得多，因而翻译出的蛋白质也少得多。强弱启动子是根据测定其合成的蛋白质分子的多少来确定的。第23页/共139页 如果突变发生在启动子上，那么-10区和-35区突变后越远离标准序列，转录的mRNA越少，这种突变称之为下降突变（down mutation）；突变后越接近标准的序列，转录的mRNA越多，这种突变称为上升突变（up mutation）。第24页/共139页 与标准启动子序列同源性愈高 启动强度愈大 与标准启动子序列同源性愈低 启动强度愈小 与标准启动子序列差异很大 由另一种因子启动E.coli;4 factor recognition 4 promoters
18、 Bacillus;10 factor recognition 10 promoters第25页/共139页 Standard 70 -TTGACA-16-18-TATAAT-Heat shock32 -TTGAA-13-15-CCCCATT-35 -10第26页/共139页4CAP位点有些启动子完全缺少共同的-35序列，例如pre、gal P和ara BAD启动子，这些启动子只有在一些正效应子分子存在时才有活力。其中的一种效应分子被称作CAP，是一种cAMP受体蛋白（cAMP acceptor protein），又称作降解物基因激活蛋白（catabolite gene activator p
19、rotein）。在lac启动子中有两个cAMP-CAP结合位点（图4-5），一个位点在-70到-50(site I)，另一个在-50到-40(site)。位点I有反向重复序列，这似乎是最强结合位点的特征。位点是很弱的结合位点，但是当CAP-cAMP复合物结合到位点I时，CAP-cAMP复合物对位点II的结合活性大大提高。第27页/共139页图4-5 在lac启动子中有两个cAMP-CAP结合位点第28页/共139页 CAP-cAMP binding site siteI+CAP-cAMP site I;IR是CAP-cAMP 的强结合位点（-70 -50）site II;CAP-cAMP 的弱
20、结合位点（-50 -40）cooperative effect提高siteII 的结合效率IR-70 site I-40site II IR-50第29页/共139页 Site II+CAP-cAMP 复合体复合体 促使促使Sextama Box 附近附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降低，岛区的双螺旋结构稳定性降低，Pribnow Box 的解链温度降低，利于转录启动的解链温度降低，利于转录启动 SiteI siteII GC Island Sextama Pribnow Null site II RNApol.into pribnow Box BNT transcription off sit
21、e II+CAP-cAMP promotionRNApol.into Sextama Boxinto Pribnow Boxstarting transcription RNApol第30页/共139页三、转录的起始（transcription initiation）关于原核生物RNA转录起始的过程，目前所了解的大致可概括如下：(1)核心酶在亚基参与下与DNA分子接触，形成非专一复合物，这样的复合物是很不稳定的；(2)起始识别：全酶与启动子结合形成封闭的启动子复合物，这时,酶与DNA的外部结合，识别部位大约在启动子的-35位处；(3)活化：得到开放的启动子复合物，酶在-10区紧密与启动子结合，
22、解开双链后识别有义链，形成转录泡（transcription bubble）（图4-6）；第31页/共139页图图4 4 6 6 含有含有RNARNA聚合酶的转录泡放大结构聚合酶的转录泡放大结构第32页/共139页(4)形成三重起始复合物：酶移动到起始点，加入第一个核苷三磷酸得到一个稳定的三重复合物(启动子、全酶、核苷三磷酸)，即开始转录。RNA链的起始是从形成开放启动子复合物开始的，一旦该复合物形成，RNA聚合酶就准备开始合成RNA，RNA聚合酶上含有两个核苷酸结合位点，分别叫做起始位点和延伸位点(initiation site and elongation site)，起始位点只结合嘌呤三
23、磷酸核苷酸即ATP和GTP。这两个嘌呤三磷酸核苷酸其中之一(常常是ATP)是RNA链上的第一个核苷酸(有时也见到有UTP，但是很少见)，因此DNA上的第一个被转录的常常是胸腺嘧啶。第33页/共139页起始的三磷酸核苷酸首先结合到酶上，再在开放的启动子复合物处与DNA上互补的碱基形成氢键。延伸位点被另一个三磷酸核苷酸结合，这个核苷酸是通过其对DNA链上起始位点下一个碱基的配对能力被严格选择的。之后起始位点和延伸位点的这两个核苷酸再结合在一起，DNA上第一个被结合的碱基从起始位点上释放出来，链起始完成。当RNA聚合酶释放碱基,并且沿DNA移动时，链延伸即开始。第34页/共139页第35页/共139
24、页四、RNA链的延伸 （transcription elongation）核苷酸不断加到RNA链的3-OH上，RNA链就延长。从起始到延伸过程的转变，DNA分子和酶分子可能发生构象的变化，以适应延伸过程的需要。当酶从起始点往下游移动，解旋也随酶一起进行。而原来部位则重新形成完整双螺旋。在转录起始阶段，全酶与DNA分子形成稳定的复合物，对连接部位的一级结构有强的专一性；而在延伸阶段，为了能沿模板移动，它必须放松对DNA的结合，而且对拷贝每一个核苷酸应具有同等能力，而不应有所偏向。链延伸几个核苷酸之后，亚基就从全酶上释放出来,亚基是可以重复使用的，随时能附着在另外的核心酶上。第36页/共139页亚
25、基的存在与否，引起与亚基构象上的变化，即当亚基缔合时，与表现为有利于专一与DNA结合的构象，而亚基释放后留下核心酶，则与DNA结合不专一，失去识别能力或优先于任一核苷酸顺序结合，不能形成稳定的复合物，如图4-7所示。第37页/共139页图图4-7 4-7 转录起始不久（合成转录起始不久（合成6 68 8个核苷酸），酶变构个核苷酸），酶变构 第38页/共139页 转录可能的模式是，在转录出一小段RNA后，亚基释放出来，核心酶不断延伸，到达终止子位点时，NusA结合在核心酶上，使得核心酶在终止子处长时间地暂停，随后因子结合上去，释放出RNA，转录终止（图4-8）。第39页/共139页图图4-8 4
26、-8 原核生物原核生物RNARNA合成示意图合成示意图第40页/共139页五、RNA链的终止和新合成RNA的释放 转录的终止是指转录的终止是指RNA聚合酶离开双链聚合酶离开双链DNA，新生的，新生的RNA分子从复合物（分子从复合物（RNA、DNA、聚合酶）脱落下来。、聚合酶）脱落下来。RNA合成的终止发生在合成的终止发生在DNA中特殊的碱基的碱基中，中特殊的碱基的碱基中，这个特殊的序列称为终止子，其功能为在这个特殊的序列称为终止子，其功能为在DNA模板上模板上的一个特定点停止的一个特定点停止RNA的合成，它们具有共同的特征的合成，它们具有共同的特征(图图4-9)。第41页/共139页终止序列具
27、有以下三个重要的区域：(1)具有一个反向重复顺序，中间是不重复的片段；(2)第二区域是在靠近推测的茎环端(有时全部在茎中)，是一个富含GC区；(3)第三个区(有时不存在)是一个AT序列(可能在茎的开始)，在mRNA中产生一个6-8个尿嘧啶序列。第42页/共139页图4-9 终止子的碱基及特征第43页/共139页RNA聚合酶延伸至终止部位时转录产物仍然与模板链以氢键结合(图4-10)；由于RNA中茎的一半已经游离出模板，通过RNA分子内相互作用而形成茎环结构，在这个区域中二元对称结构的变异将对茎环的形成发生重要影响；这时，RNA聚合酶就从“延伸”构象转变为“终止”构象。又由于茎环后一般为数个连续
28、的U，rU-dA配对的DNARNA杂交体很不稳定而释放出转录产物。第44页/共139页 转录的终止有两种形式，一种是不依赖于终止蛋白Rho()因子而靠DNA自身的顺序终止，另一类是需要识别终止蛋白(蛋白)的作用终止转录。第45页/共139页图图4-10 4-10 转录终止及链释放模型转录终止及链释放模型第46页/共139页第47页/共139页 在依赖的终止位点处结构不够稳定，RNA聚合酶只是在此暂停但不终止，需要的帮助才能停止转录。因子一种相对分子质量为2.0105的六聚体蛋白，能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。因子能促使新生的RNA链从转录复合物中解离出来，从而终止转录（图411）
29、。图411 因子的“热追踪(hot pursuit)”模型图 第48页/共139页“热追踪”模型模型假设因子与新生RNARNA链的终止子上游某位点结合，然后沿mRNAmRNA追踪RNARNA聚合酶。当酶遇到终止子时就暂停，因子在此处追赶上，终止发生。因子有螺旋酶的作用，在ATP 提供能量时，能使RNA-DNA杂交链分离。终止过程完成后，因子和RNA聚合酶都要从核酸链上释放出来（图412）。第49页/共139页图412 细菌中mRNA的转录、翻译和降解示意图第50页/共139页第二节 RNA分子的种类及转录后加工RNA分子主要分三种类型：mRNA(messenger RNA)rRNA(ribos
30、omal RNA)tRNA(tranfer RNA)第51页/共139页与一个多肽链相对应的DNA片段加上启动部位再加上终止部位叫做一个顺反子，一次转录下来的mRNA可以含一个顺反子也可以含多个顺反子，分别叫做单顺反子mRNA(mono-cistron mRNA)和多顺反子mRNA(poly-cistron mRNA)。许多原核mRNA起始密码子AUG上游处712个核苷酸处有一小段称为核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）的序列，又可称作SD序列（Shine-Dalgarno sequence，SD）。该序列与16S rRNA的3端的一段序列互补，在核糖体-mRN
31、A的结合过程中发挥作用。一、mRNA的结构第52页/共139页 细菌基因的转录和翻译是紧密相连的，转录开始时，核糖体便与mRNA 5端结合并开始翻译，一串核糖体会在mRNA合成时沿着mRNA移动。核糖体在mRNA尚未降解之前持续翻译，但是mRNA通常沿53方向快速降解（图4-12）。原核生物mRNA的一个重要特点是它的寿命比其tRNA和rRNA的短，其mRNA的半衰期只有几分钟。第53页/共139页图412 细菌中mRNA的转录、翻译和降解示意图第54页/共139页二、稳定RNA：核糖体RNA和转移RNA对蛋白质合成来说，除了需要mRNA作翻译模板外，还需核糖体RNA(rRNA)作合成的场所，
32、转移RNA(tRNA)作为转运氨基酸的工具。rRNA和tRNA在代谢中比mRNA稳定。rRNA和tRNA有以下三点特性与mRNA不同：第一，所有的初级转录产物的5末端均是5三磷酸，而rRNA和tRNA分子的5末端是5单磷酸；第二，rRNA和tRNA分子比其初级转录产物小得多；第三，所有tRNA除了含有A、G、C和U外还含有稀有碱基，这些稀有碱基在初级转录产物中是没有的。第55页/共139页1、tRNA分子的加工 tRNA的种类远比rRNA要多，在原核生物中有30-40种，真核生物则更多，大约有60种以上。在原核生物中，一些tRNA基因是和rRNA基因连接在一起的。包括间隔区中的tRNA基因和末
33、端的tRNA基因。此外，tRNA基因大多以基因簇存在，构成多顺反子转录单位。tRNA前体的加工内容主要包括以下三个方面：(1)剪切、修剪和剪接；(2)如果需要，在3端添加CCA-OH；(3)核苷修饰（图4-13）。第56页/共139页图图4-13 4-13 大肠杆菌一种大肠杆菌一种tRNAtRNA加工示意图加工示意图 第57页/共139页p tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定大小的tRNA分子。大肠杆菌RNase P（tRNA5成熟酶）可特异剪切tRNA前体的5端序列。除了RNase P外，tRNA前体的剪切尚需要一个3-核酸内切酶，这可将tRNA前体3端的一段核苷酸序列切下来。p
34、 成熟的tRNA分子中有许多的稀有碱基。tRNA在甲基转移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如AmA，GmA。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变为假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脱氨基成为次黄嘌呤核苷酸。第58页/共139页2.rRNA前体的后加工p原核生物原核生物rRNA转录后加工，包括以下几方面：转录后加工，包括以下几方面：rRNA前体被大肠杆菌前体被大肠杆菌RNase，RNaseE等剪切成等剪切成一定链长的一定链长的rRNA分子；分子；rRNA在修饰酶催化下进行在修饰酶催化下进行碱基修饰；碱基修饰；rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基（图亚基（图414）。
35、）。第59页/共139页图414 大肠杆菌rRNA加工简图第60页/共139页第三节第三节 真核生物的转录和真核生物的转录和RNA加工加工一、真核生物RNA聚合酶 真核生物RNA聚合酶分三类（表42），每种酶合成不同类型的RNA。RNA聚合酶（RNA pol）是唯一在核仁中的RNA聚合酶。RNA聚合酶（RNA pol）只在核质中，转录mRNA、某些snRNAs 和核内不均一RNA。RNA聚合酶（RNA pol）也在核质中，催化合成tRNAs、5SRNA和某些snRNA。不同的真核生物聚合酶对各种抑制剂的敏感性也不同（表43）。第61页/共139页表表4 4 2 2 真核生物三种真核生物三种RN
36、ARNA聚合酶的特点聚合酶的特点RNA聚合酶聚合酶位置位置 产物产物相对活性相对活性对对-鹅膏蕈的敏感性鹅膏蕈的敏感性RNA聚合酶聚合酶核仁核仁 28s,18s,5.8s rRNAs 5070%不敏感不敏感RNA聚合酶聚合酶核质核质 hnRNA,mRNA,某某些些snRNAs2040%高度敏感高度敏感RNA聚合酶聚合酶核质核质 tRNA,5SrRNA,某某些些snRNAs10%片段特异，中等敏感片段特异，中等敏感第62页/共139页二、真核生物的转录 真核基因的转录如同原核基因的转录一样，包括真核基因的转录如同原核基因的转录一样，包括起始、延伸和终止等阶段，但过程更复杂，涉及更多的起始、延伸和
37、终止等阶段，但过程更复杂，涉及更多的酶和蛋白因子。真核的核内酶和蛋白因子。真核的核内RNARNA聚合酶有聚合酶有3 3种类型，有更种类型，有更多的基因多的基因DNADNA序列元件和形形色色的蛋白质因子参与转序列元件和形形色色的蛋白质因子参与转录的各个过程，因此受到更为复杂的调控。录的各个过程，因此受到更为复杂的调控。第63页/共139页与原核基因相比，真核基因的转录具有一些特殊规律，主要包括：（1）典型的真核基因转录单元为单顺反子，而原核基因转录单元为多顺反子。（2）真核生物的RNA聚合酶高度分工。核内三种RNA聚合酶分别转录不同类型的核基因，不同性质和功能的RNA由不同的RNA聚合酶负责催化
38、合成。其中，RNA聚合酶II（转录生成hnRNA）被认为是真核生物中最活跃、最复杂的RNA聚合酶。第64页/共139页图414 真核RNA聚合酶II的基本组成及其亚基的功能第65页/共139页（3）转录的正常进行，除了需要）转录的正常进行，除了需要RNA聚合酶以外，还需要许多蛋聚合酶以外，还需要许多蛋白质因子的参与。这些蛋白质因子具有两大功能：白质因子的参与。这些蛋白质因子具有两大功能：将将RNA聚合聚合酶募集到核心启动子区域，构建成转录起始复合体。酶募集到核心启动子区域，构建成转录起始复合体。调节调节RNA聚合酶活性的因子，称为转录调控因子（聚合酶活性的因子，称为转录调控因子（transcr
39、iption regulation factors）。）。第66页/共139页（4）真核基因）真核基因DNA的顺式作用元件（的顺式作用元件（cis-acting element）要比原）要比原核基因复杂得多。真核生物基因的顺式作用元件主要包括启动子、核基因复杂得多。真核生物基因的顺式作用元件主要包括启动子、增强子、负调控序列元件和可诱导元件等。他们只有与特异性蛋增强子、负调控序列元件和可诱导元件等。他们只有与特异性蛋白质因子结合以后，才会起作用。这些蛋白质因子称为反式作用白质因子结合以后，才会起作用。这些蛋白质因子称为反式作用因子因子(trans-acting factor)。（5）真核基因的
40、转录调控以正调控为主。基因转录活性要求很多）真核基因的转录调控以正调控为主。基因转录活性要求很多种类蛋白质因子的存在和协同作用。种类蛋白质因子的存在和协同作用。第67页/共139页1.真核生物的启动子 真核生物中有三种RNA聚合酶，因此也有三类不同的启动子，其中以RNA聚合酶的启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定。有的有多种框如组蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白；（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转
41、录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNA聚合酶结合。转录的起始是先与通用转录因子结合，RNA聚合酶是被通用转录因子招募进来的。第68页/共139页（1）RNA聚合酶启动子及起始RNA聚合酶的启动子变化最小，RNA pol仅从单一类型的启动子转录rRNA基因，初始转录产物经过加工产生成熟的rRNAs。RNA聚合酶需要2种辅助因子：UBF1（upstream binding factor 1）和SL1（选择因子），UBF1结合在核心启动子特异序列UPE上，SL1与UBF-DNA复合物结合使其稳定，然后RNA聚合酶结合进来，起始转录（图415）。第69页/共139页图415 真核生物RNA聚
42、合酶的启动子及转录起始过程第70页/共139页u TBP也是RNA聚合酶和RNA聚合酶起始时所需的一种蛋白质因子。TBP的功能是与DNA结合（图415）。SL1另一些组分的功能负责与DNA结合的种特异性。第71页/共139页（2）RNA聚合酶启动子及起始 人们比较了上百个真核生物RNA聚合酶的启动子（类启动子）核苷酸序列后发现，类启动子由两大部分组成：上游启动子元件（upstream promoter element，UPE)和核心启动子(core promoter)。上游元件与转录的效率有关；核心启动子包括3部分：TATA框（TATA box）、起始子(initiator，Inr)及下游启动
43、子元件(downstream promoter element，DPE)（图416）。第72页/共139页 TATA框又称Hogness框，一致序列是：TATAAAA，位于-25-30左右，其作用是：(1)选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子（selector），当有的基因缺少TATA框时，可能由Inr来替代它的这一作用；(2)影响转录的速率。当TATA序列突变和缺失影响酶的结合能力，从而影响转录的能力。上游启动子包括CAAT框（CAAT box）、GC框（GC box）等（图416），它们的保守序列和结合的蛋白质因子也各不相同。第73页/共139页 图416 真核生物RNA聚
44、合酶的启动子 在核心启动子之外，还存在一些体内进行有效转录所需的其他元件，这些元件共同组成调节序列，包括：增强子（enhancer）、减弱子（dehancer）、沉默子（silencer）、绝缘子（insulator）和上游激活序列（upstream activating sequences,简称UASs）。第74页/共139页TATA +1 Wilds minor groove TFII A TBP of D pre-TIC TFII F RNApol IITFII B Basic TIC 第75页/共139页mRNA Promoter clearance E H B D ATranscri
45、ption startingcomplete TIC EH第76页/共139页 -RNApol II +20TFIIs TIC 转录启动 (Transcriptional Initiation Complex)逐级组装逐级组装逐级组装第77页/共139页增强子：增强子广泛存在于真核基因组中。增强子的特点是：具有远距离效应。可增强远处启动子的转录；无方向性。无论在靶基因的上游、下游都可发挥增强转录的作用；顺式调节。只调节位于同一染色体体上的靶基因，而对其它染色体上的基因无作用；无物种和基因的特异性，可以接到异源基因上发挥作用，如将SV40的增强子接到兔-珠蛋白基因前，引入Hela细胞，此珠蛋白基
46、因转录增强200倍；具有组织的特异性。SV40的增强子在3T3细胞中比多瘤病毒的增强子要弱，但在Hela细胞中SV40的增强子比多瘤病毒的要强5倍，抗体基因的增强子只有在B淋巴细胞中才起作用；第78页/共139页 增强子与特异性的增强子结合蛋白结合后，再通过与转录起始复合物中的蛋白质相互作用而增强转录（图4-17），即所谓的承欢模型。第79页/共139页 En.Elem.En.Elem En.Elem.-250 -180 coreC TCII TCI sphII sphI Ap3 Ap2 Ap1e.g.SV40 Enhancer(-179-250)远距离控制，无方向性 mRNA +1GC CA
47、AT TATA 促进转录复合体基本转录复合体图417 增强子的作用机制第80页/共139页 减弱子：在某些基因的上游远端或下游远端具有负调节序列，其作用不受距离和方向的影响，叫做减弱子。沉默子：在酵母交配型转换的盒式模型中，左右两个沉默框（HML和HMR）都不表达，起抑制作用，故称沉默子，可与启动子作用。绝缘子（或边界元件，boundary element）：能将基因的激活（或增强）和抑制作用控制在一定范围内的DNA序列。上游激活序列（upstream activating sequences,简称UASs）：UASs是酵母中远上游序列，类似于增强子。第81页/共139页（3）RNA聚合酶启动
48、子及起始 RNA聚合酶启动子一般分成基因内启动子和基因外启动子两类，它们是由不同的转录因子以不同的方法来识别的。5SRNA和tRNA都属于RNA聚合酶启动子，但它们比较特殊，位于起始位点的下游的转录区内，因此也称为下游启动子（downstream promoter）或基因内部启动子（intragenenic promoter）或称为内部控制区（internal control regin）。5SRNA的启动子是在基因中的+55+80之间。转录起始点在+55的更上游的位置。第82页/共139页p 内部启动子主要有两种类型：型基因内部启动子含有两个分开的A框和C框序列。而型基因内部启动子含有两个分
49、开距离较大的A框和B框（图418）。p TFB结合在起始位点上并和TFC相连（图419），RNA聚合酶启动子的转录因子结构功能见表44。第83页/共139页转录因子转录因子 结构结构功能功能TF A38kD，有，有9个锌指个锌指结合于结合于型内部启动子型内部启动子(5SRNA基因基因)的的C框，使框，使 C结合在结合在C框下游，辅助框下游，辅助 B定位结合定位结合TF B含含TBP和另外二种和另外二种蛋白蛋白定位因子，使定位因子，使Pol结合在起始位点上结合在起始位点上TF C含含A和和B，有，有5个个亚基亚基B结合结合型内部启动子型内部启动子(tRNA基因基因)的的B框，起增框，起增强子的作
50、用。强子的作用。A结合结合A框，起启动子的作用；框，起启动子的作用；辅助辅助B定位结合定位结合TBP是是TFB，D，SL1的亚基的亚基和特异和特异DNA序列及序列及RNApol结合，使结合，使Pol结合在正结合在正确的位点上确的位点上TFD含含TBP亚基亚基结合结合TATA框，确定选择框，确定选择RNA pol PBP次近端结合蛋白次近端结合蛋白可能和可能和TFD一道辅助一道辅助TF B定位结合的另一途定位结合的另一途径径表44 RNA pol 启动子的转录因子的结构和功能第84页/共139页p 这些因子中，只有TFB才是RNA聚合酶所必需的起始因子。TFA和TFC仅是一种装配因子，它们的作用