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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流动物细胞工程.精品文档.细胞工程第一讲一、概述1、细胞工程（cell engineering）定义应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。2、细胞工程的研究内容细胞工程动植物细胞和组织培养细胞融合染色体工程胚胎工程细胞遗传工程器官培养组织培养细胞培养（快速繁育和产物大量制备）（改良性状，培育新品种）（培育新品种，单倍体和多倍体）（获得人们需要的成体）（无性繁殖，改变性状）克隆转基因技术（1）动植
2、物细胞和组织培养植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备，日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。动物细胞培养用于制备单克隆抗体、疫苗、生长因子等。（2）细胞融合改良性状，培育新品种（3）染色体工程主要用于培育单倍体或多倍体新品种，如四倍体小麦，八倍体小黑麦（4）胚胎工程主要是获得人们需要的成体如：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿（5）细胞遗传工程克隆：无性繁殖，动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。转基因技术：将外源基因整合到生物体内，能够表达并稳定遗传给后代的实验技
3、术。3、细胞工程的优势（1）避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。（2）不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展（1）萌芽阶段-理论渊源和早期的尝试（20世纪初-30年代中期）德国植物生理学家Haberlandt在1902年提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人，1907年，以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程，首创了体外组织培养法。（2）奠基阶段-离体培养技
4、术的建立（ 20世纪30年代中期-50年代中期）1934年美国植物生理学家White通过培养番茄根，建立活跃生长的无形繁殖系，并且在28年间转接培养1600代仍能生长。并正式提出植物细胞全能性学说。1940年，Earle建立无限传代的小鼠结缔组织L细胞系；1954年，美国微生物学家索尔克利用原代培养的猴肾细胞制备脊髓灰质炎疫苗并进入工业化生产。（3）蓬勃发展阶段-各种新物种的出现（20世纪50年代末-至今）1958年，利用胡萝卜髓细胞形成了体细胞胚，并发育成完整植株。1960年，植物原生质体和体细胞杂交成功。在育种及次生代谢产物生产方面飞速发展，1958年，冈田善雄灭活的仙台病毒诱导肿瘤细胞融
5、合，开创了细胞融合的崭新领域。三色鼠：绵山羊： 5、细胞工程的应用（1）粮食与蔬菜生产 利用细胞工程技术进行作物育种，是迄今人类受益最多的一个方面。我国在这一领域已达到世界先进水平，培育出的水稻品种或品系有近百个，小麦有30个左右。培育的新品种，具有抗倒伏、抗锈病、抗白粉病等优良性状。 （2）园林花卉 植物细胞工程技术使现代花卉生产发生了革命性的变化。如：世界兰花市场上有150多种产品，其中大部分都是用快速繁殖技术得到的试管苗。从此，市场供应摆脱了气候、地理和自然灾害等因素的限制。至今，已报道的花卉试管苗有360余种。已投入商业化生产的有几十种。我国对康乃馨、月季、唐昌蒲、菊花、非洲紫罗兰等品
6、种的研究较为成熟，有的也已商品化，并有大量产品销往港澳及东南亚地区。 （3）临床医学与药物 单克隆抗体并已成功地应用于临床治疗，主要是针对一些还没有特效药的病毒性疾病，尤其适用于抵抗力差的儿童。 人类体外受精技术的日趋成熟，使人类对生育活动有了较大的选择余地，促进优生优育，提高人口素质，也为不孕症患者或不宜生育的人带来福音。 生物药品主要有各种疫苗、菌苗、抗生素、生物活性物质，抗体等，是生物体内代谢的中间产物或分泌物。过去制备疫苗是从动物组织中提取，得到的产量低而且很费时。现在，通过培养、诱变等细胞工程或细胞融合途径，不仅大大提高了效率，还能制备出多价菌苗，可以同时抵御两种以上的病原菌的侵害。
7、 （4）繁育优良品种 目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产，使优良公畜、禽的交配数与交配范围大为扩展，并且突破了动物交配的季节限制。另外，可以从优良母畜或公畜中分离出卵细胞与精子，在体外受精，然后再将人工控制的新型受精卵种植到种质较差的母畜子宫内，繁殖优良新个体。综合利用各项技术，如胚胎分割技术、核移植细胞融合技术、显微操作技术等，在细胞水平改造卵细胞，有可能创造出高产奶牛、瘦肉型猪等新品种。6、细胞工程产业化发展前景（1）新兴高技术产业（2）细胞工程产品的应用 人生长激素、促红细胞生成素、溶血栓药物、MAb（3）医学治疗 基因治疗、人造器官、干细胞治疗、体细胞治疗、抗癌免疫细
8、胞治疗二、体外培养细胞的分型1、悬浮型细胞（suspend cell）不需要贴附在支持物上，而是呈悬浮状态生长。细胞悬浮生长时胞体为圆形。细胞悬浮培养的优点是细胞生存空间大,生长时间长,能繁殖出大量细胞。观察细胞病变时不如贴壁细胞方便。2、贴壁型细胞（anchorage-dependent cell）细胞必须贴附在某一固相支持物上才能生长。贴壁型细胞又分为4种1）上皮型细胞（epithelium）：细胞呈扁平不规则多角形，中间有细胞核，彼此紧密连接。2）成纤维型细胞（fibroblast）：细胞贴壁后呈梭形或不规则三角形。3）游走型细胞（wandering）：细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游
9、走或变形运动，分散生长不连接成片。4）多形型细胞（polymorphic）：呈多角形，并伸出很长的神经纤维，很难确定其形状。三、动物细胞的特点1、动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。2、动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易污染。3、培养过程需氧少，对机械搅拌或剪切力敏感。4、动物细胞间主要以聚集体形式存在。5、原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。四、动物细胞培养的定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。五、动物细胞培养的基本条件1、培养工具2、培养器皿细胞培
10、养板、培养瓶3、培养条件（1）温度：37偏离这一温度，细胞的正常代谢就会受到影响，甚至造成细胞的死亡。总的来说，细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强。温度不超过39度是，代谢强度与温度成正比；39-40度历时1小时，会受到损伤，但仍可能恢复；41-42度，会受到严重损伤；43度以上时，细胞全部杀死。（2）pH：7.2-7.4 不同细胞对pH的要求不一样。但总起来说，原代细胞对pH的耐受差，而传代细胞和肿瘤细胞对pH变动的耐受强。低于6.8或高于7.6都会对细胞产生不利的影响，严重时导致细胞蜕变或死亡。（3）气体：氧，二氧化碳氧气参与三酸酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖、及合成所需的细胞成分。
11、但是不能过高或过低，过低时影响生长代谢，过高时产生细胞毒性。二氧化碳对于调节培养液的pH至关重要。碳酸氢钠调节pH，NaHCO3+H2O=Na+ HCO3-+H2O=Na+ + CO2 + H2O + OH-（4）渗透压4、细胞培养常用液体1）水: 配制各种培养液必需用纯水或新蒸馏的三蒸水。2）平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）: 平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。3） 消化液：胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴
12、附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。 4）pH调整液：常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。 5）常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。通常使用青霉素终浓度0.007-0.008g/100ml,链霉素终浓度0.01g/100ml。一般配制成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。 5、天然培养基（natural medium) 血清成分由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质能促进细胞生长增殖。血清种类胎牛血清（
13、fetal calf serum）, 新生犊牛血清（newborn calf serum）, 小牛血清（calf serum）, 马血清（horse serum）,兔血清（rabbit serum）,羊血清（sheep serum）,人血清（human serum）血清的灭活血清经56水浴30min，以避免血清中的补体成分对细胞的毒性作用。血清的主要作用1）提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。2）提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因
14、子、血小板生长因子等。3）提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。4）提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。5）对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。6、合成培养基组成1. 氨基酸组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。2维生素
15、维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源， 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。VA是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体，对上皮细胞有重要的维护作用。VD参与调节钙的吸收。VE是抗氧剂，可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪酸被氧化。VK缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长。叶酸是合成四氢叶酸的重要原料，四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用。生物素是一些特异羧化酶的组成部分，参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。3碳水化合物碳水化合
16、物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。4无机离子钠、钾、镁、钙、磷等基本的无机离子，这些都是细胞组成所必须并参与细胞的代谢。7、合成培养基的种类天然培养基虽然营养丰富，能有效促进细胞在体外的生长增殖，但存在成分复杂、批次间差异大、易污染、制备过程繁琐等种种问题。合成培养基是根据细胞所需营养成分的基础上，用化学物质人工模拟合成的。TC199 DMEM RPMI1640 McCoy5A F12六、细胞培养的基本技术1、原代培养(primary culture) ： 又叫初始培养，指由机体取得材料（细胞、组织或器官），培养到第一次
17、传代前，即为原代培养。特点: 一般持续1一4周此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。 2、原代培养步骤取材 剪碎 解离释放细胞 细胞培养3、原代培养取材应注意的问题 取材的部位 所取材料是否保持活性 材料处理是否得当 无菌操作 若路途较远取材后立即冷却4、传代培养（subculture ） 将原代培养的细胞分离、稀释并接种到含有新鲜培养基的新培养容器内继续培养，该过程叫做传代培养。 5、细胞为什么要进行传代？ 随着培养时间的延长和细胞不断
18、分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，或者生长空间不足，生长速度减慢、停止甚至死亡； 另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。 细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的各种细胞类型所组成。细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。有限细胞株（finitecell strain）：不能继续传代或传代数有限。连续细胞株（continuous cell strain）：可以连续传代。对于人类肿瘤细胞，在
19、体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。细胞克隆技术（cell cloning） 又称单细胞克隆（single cell cloning）或单细胞培养（single cell culture），把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。动物体细胞核移植技术动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。细胞拆合技术将细胞核和细胞质用某种方法拆开，然后再把分离的细胞核和胞质体重新组合成一个新细胞。把从细胞中分离出来的染色体或基因转入另一个细胞中，赋予重建的细
20、胞以某种新的功能，这属于染色体导入或基因转移的技术范畴。 体外受精-胚胎移植技术（In vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）指精子与卵子在体外受精形成受精卵，发育至4-8个细胞期（如条件允许，可发育至囊胚）时移植入子宫腔，并在子宫内着床、生长至足月。 7、细胞的冻存和复苏 保存细胞的一种方法原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。 如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。 在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透
21、出细胞。 液氮中冻存1-2年后，细胞存活率80%-90%。 常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油。 基本原则：慢冻快融。8、细胞的冻存步骤1、消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养基，计数，调整至5106/ml左右。4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。5、将冻存管口封严。6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。7、按下列顺序降温：室温4（20分钟冰箱冷冻室（30分钟）低温冰箱（30 1小时）气态氮（30分钟）液氮。9、细胞的复苏步骤1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37的温水。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37培养，第二天观察生长情况思考题 动物细胞培养的培养基主要有哪几类？各有何特点？ 动物原代细胞培养取材时应注意哪些问题？ 动物细胞培养时为什么要进行传代？传代方法及适用范围是什么？